Тец мікробіологія практикум. Практикум з мікробіології

Департамент освіти міста Москви

Технологічний коледж №28

Жукова Л.А.

МЕТОДИЧНІ ВКАЗІВКИ

до лабораторних робіт №№1-4

Для учнів професії НУО

Москва

2012

«Основи мікробіології, санітарії та гігієни»

МЕТОДИЧНІ ВКАЗІВКИ

до лабораторних робіт №№1-4

для учнів професії НУО

34.17 Оператор ковбасного виробництва.

_______________________________________________________________

Посібник призначений студентам коледжу. Може бути використано для самостійної підготовки до навчальних занять та позааудиторної самостійної роботи.

Упорядник: Жукова Л.А. – викладач спеціальних дисциплін

Рецензент: Суханова Н.В. – викладач спеціальних дисциплін

Редактор: Малькова Л.А. – заступник директора з навчально-методичної роботи

Рукопис розглянуто та обговорено на засіданні ЦМК Технологічних дисциплін, протокол № __ від __ _______ 2012р.

ПОЯСНЮВАЛЬНА ЗАПИСКА

Методичні вказівки розроблені відповідно до чинної програми курсу мікробіології, прийнятої ДАОУ СПО міста Москви Технологічним коледжем №28 для студентів, які навчаються за спеціальністю 260301 «Технологія м'яса та м'ясних продуктів».

На сучасному рівні розвитку природничих наукпотрібні глибокі знання мікробіологічних процесів, що лежать в основі багатьох біотехнологічних виробництв та службовців гарантією захисту довкіллявід антропогенної дії.

Крім придбання теоретичних знань з мікробіології майбутнім спеціалістам необхідні лабораторно-практичні заняття, які є насправді невеликими науково-дослідними роботами.

Виконання лабораторних робіт забезпечує закріплення теоретичних знань студентів, розвиток навичок з мікробіологічного контролю та здібностей до самостійних висновків та узагальнення.

Дані методичні вказівки щодо виконання лабораторних робіт пропонують:

об'єднати лабораторні роботи з однієї теми чи мають одне змістове зміст те щоб зручно було їх організувати у часі, як це вимагає специфіка мікробіологічних аналізів;

розподілити заняття так, щоб завантаженість останнього заняття давала змогу обговорити результати аналізу, провести залік із виконаної роботи;

сконцентрувати найважливіший навчальний матеріал, що дозволяє студентам без зайвої завантаженості освоїти практичні навички роботи у мікробіологічній лабораторії;

дати методику проведення аналізу із зазначенням сутності методу, техніки виконання, правил обробки результатів;

використовувати методи мікробіологічного аналізу, передбачені ГОСТом.

Тема та мета роботи.

Матеріальне забезпечення роботи.

Рекомендації щодо виконання лабораторної роботи, завдання, пояснення до роботи, методика проведення аналізів, форми для складання звіту, контрольні питання до лабораторних питань та додаткова література.

Зважаючи на складність деяких методів та тривалість вирощування мікроорганізмів в окремих випадках частину лабораторного матеріалу готує заздалегідь викладач, але методика приготування його наводиться.

Навички, набуті на лабораторних заняттях, необхідні для проведення мікробіологічного контролю виробництва, мета якого полягає в тому, щоб своєчасно виявити порушення санітарного стану виробництва та обладнання, виявити місця та шляхи мікробного забруднення, вжити необхідних заходів щодо ліквідації цих небезпечних вогнищ та домогтися випуску продукції високого якості.

ПРАВИЛА РОБОТИ В МІКРОБІОЛОГІЧНІЙ ЛАБОРАТОРІЇ

Робота в мікробіологічній лабораторії потребує суворого дотримання спеціальних правил, що визначається двома основними положеннями.

Перше – у мікробіологічній практиці використовують, головним чином, чисті культури мікроорганізмів, т. е. популяції мікроорганізмів одного виду, які часто є потомством однієї клітини.

Оскільки в повітрі, на поверхні навколишніх предметів, на одязі, руках, волоссі завжди є велика кількістьрізноманітної мікрофлори, то для забезпечення стерильності досліджень та, щоб уникнути забруднення культур, робота повинна проводитися з дотриманням правил асептики.

Друге - при дослідженнях з неідентифікованими мікроорганізмами, при їх виявленні з об'єктів навколишнього середовища та техногенних потоків, можуть бути виділені патогенні та умовно-патогенні мікроорганізми.

Крім того, клітини як сапрофітних, так і патогенних мікроорганізмів можуть бути алергенами для певних індивідуумів. Таким чином, для отримання достовірних результатів досліджень, для забезпечення особистої безпеки та безпеки оточуючих необхідно дотримання певних правил.

При пересіванні мікроорганізмів стерильність досягається за рахунок того, що вся робота проводитьсяпоблизу полум'я пальники. Бактеріологічні петлі, що використовуються для пересівання мікроорганізмів з твердих середовищ, прожарюють у полум'ї пальника, а скляний посуд та живильні середовища попередньо стерилізують у сушильних шафах та автоклавах відповідно.

Поверхня робочого столу дезінфікують як перед роботою, так і після її закінчення, протираючи 3% розчином хлораміну, лізолу або 70% розчином ізопропілового або етилового спирту. Розчини цих спиртів можуть застосовуватися і для дезінфекції рук.

Підготовка приміщення включає мокре прибирання та ретельну вентиляцію з подальшим опроміненням ультрафіолетовим світлом бактерицидних ламп. Залежно від ступеня забрудненості повітря для його стерилізації потрібно опромінення від 30 хвилин до кількох годин. Ультрафіолетові промені є небезпечними для очей, тому при включеній бактерицидній лампі в приміщенні перебувати не можна.

При роботі в мікробіологічній лабораторії учні повинні дотримуватись наступних правил:

1. Кожен студент має працювати на постійному місці.
2. На робочому місці не повинно бути сторонніх предметів (у тому числі портфелів та сумок). Під час роботи з пальником на столі не повинно бути також зошитів, які знадобляться пізніше при мікроскопії та замальовуванні препаратів.
3. Вся робота виконується у чистому халаті. Довге волоссяповинні бути підібрані, щоб уникнути їх потрапляння в полум'я грілки.
4. На посуді, що застосовується для культивування мікроорганізмів (пробірки, колби, чашки Петрі, матраци), повинні бути зроблені написи, що містять родову та видову назву культури, дату засіву, прізвище студента та номер групи.
5. Всі предмети, використані при роботі з живими культурами, повинні бути знезаражені або обпалюванням в полум'ї пальника, або занурені в дезінфікуючий розчин (предметне та покривне скло, піпетки, шпателі).
6. Усі засіяні пробірки, чашки чи колби поміщаються у термостат чи здаються лаборанту.
7. Відпрацьований матеріал міститься у певні ємності для їх подальшого знезараження.
8. У лабораторії суворо забороняється куріння та прийом їжі.
9. Наприкінці занять кожен студент повинен упорядкувати робоче місце.

Отримані дані мають бути зафіксовані у журналі для лабораторних робіт. Записи повинні містити: номер та назву роботи, дата її початку та закінчення, назви об'єктів досліджень, умови проведення дослідів, методи аналізів, а також отримані результати та висновки з них. При вивченні морфології культур робляться їх замальовки за певних збільшення мікроскопа. (На заняттях слід мати кольорові олівці, як мінімум, червоний і синій.) Цифрові дані узагальнюються в таблицях, графіках або діаграмах.

ЛАБОРАТОРНА РОБОТА №1

Організація та обладнання мікробіологічної лабораторії. Влаштування оптичного мікроскопа та правила роботи з ним. Освоєння техніки мікроскопування бактерій.

Мета заняття.

Ознайомити студентів з організацією та обладнанням мікробіологічної лабораторії. Вивчити пристрій оптичного мікроскопа. Ознайомитись з основними формами бактерій.

Матеріальне забезпечення.

Навчальна мікробіологічна лабораторія, оснащена термостатами, стерилізаторами, холодильниками, водяною лазнею, дистилятором, бактерицидними лампами, робочими столами з усім необхідним приладдям, мікроскопами.

Ця лабораторна робота містить значний обсяг навчального матеріалу, тому ознайомити студентів з організацією та обладнанням лабораторії бажано демонстраційним методом.

При вивченні пристрою мікроскопа використовувати плакат, де показані всі деталі.

Завдання.

1. Ознайомитись з поясненням до роботи:

1. Обладнання навчальної мікробіологічної лабораторії.
2. Оснащення та організація роботи виробничої

1. Правила роботи у мікробіологічній лабораторії.
2. Пристрій оптичного мікроскопа та догляд за ним.

Правила роботи із мікроскопом МБР-1.

1. Основні форми бактерій.

1. Провести мікроскопію готових препаратів із основними формами

Бактерії.

Пояснення до роботи

1.1 Обладнання навчальної мікробіологічної лабораторії.

Приміщення навчальної мікробіологічної лабораторії має складатися з навчальної, технічної кімнат та кімнати викладача.

У навчальній кімнаті має бути наступний інвентар: лабораторні столи, столи для мікроскопування, стіл для викладача, термостати, табурети, полиця з титрованими розчинами, ваги, класна дошка, стіл для посуду, раковина.

Для навчальних занять можна використовувати звичайний лабораторний стіл.

Стіл для мікроскопування необхідно встановлювати перед вікном; його висота має бути близько 80 см, ширина – близько 40 см. Для більшої стійкості стіл для мікроскопування влаштовують на кронштейнах.

Термостати. Мікроби необхідно вирощувати за таких умов, щоб температура навколишнього повітря піддавалася, можливо, меншим коливанням. Для цього застосовують термостати, що є шафами, в яких підтримується. постійна температура.

Існують повітряні та водяні термостати.

Повітряні термостати обігріваються теплим повітрям, яке зазвичай нагрівається, електричним струмом.

У водяних термостатах між подвійними стінками знаходиться вода, що нагрівається електричним струмом, газом або іншими джерелами тепла. Коливання температури у цих термостатах менше, ніж у повітряних.

У лабораторії має бути не менше трьох термостатів: температура одного 30С, другого 37С і третього 43С. Мікробів, що добре розвиваються при 20˚С, можна вирощувати при кімнатній температурі.

Постійна температура у термостатах підтримується спеціальними пристроями – терморегуляторами. У термостаті з точним терморегулятором коливання температури не повинні перевищувати 2С.

Автоклав або стерилізатор.Автоклав є металевим циліндром з подвійними стінками і масивною кришкою, яка закривається гвинтовими затискачами.

На циліндр одягається металевий кожух. Автоклав забезпечений паровідвідною трубкою, манометром, запобіжним клапаном та водомірним склом. У ньому стерилізують живильні середовища, різні рідини та посуд.

Перед стерилізацією в автоклав через вирву водомірного скла наливають дистильовану або кип'ячену воду(при вживанні сирої води швидко утворюється накип) до межі, вказаної на кожусі автоклава. Після цього автоклав завантажують матеріалом, що підлягає стерилізації (останній необхідно зверху закривати папером), міцно загвинчують кришку, відкривають кран паровідвідної трубки і починають підігрівати.

Нагрівання здійснюється електрикою, парою (у цьому випадку воду в автоклав не наливають) або кількома газовими пальниками. У міру нагрівання з автоклава починає виходити спочатку повітря, а потім пара, яка надходить в автоклав через отвори у верхній частині циліндра. Коли пара почне виходити безперервним струменем, його випускають ще 2-3 хвилини для витіснення повітря з автоклаву, а потім закривають кран. Внаслідок цього припиняється вихід пари і поступово в автоклаві починає підвищуватись тиск (підйом стрілки манометра).

Після встановлення необхідного тиску рівень нагрівання автоклава зменшують так, щоб стрілка манометра залишалася на одному рівні протягом певного часу. Початок стерилізації вважається з досягнення стрілкою належного тиску.

Показання манометра відповідають певній температурі пари.

Показання манометра в атм Температура пари в ˚С

0,5 112,0

1,0 121,4

1,5 128,8

2,0 135,1

Після закінчення стерилізації нагрівання припиняють і дають стрілці манометра впасти до нуля. Тільки після цього відкривають кран паровідвідної трубки, випускають пару і впускають повітря, потім відкручують кришку, піднімають її і, давши в такому положенні охолонути автоклаву, виймають простерилізований матеріал.

Посуд та інвентар.

Чашки Петрі служать для посіву культур. Вживають чашки діаметром 10 см (висота 1,5 см). Скло має бути тонким, прозорим, без бульбашок повітря.

Піпетки. При бактеріологічній роботі використовують піпетки ємністю 1-5 та 10 мл. Найчастіше застосовують піпетки ємністю 1 мл, довжиною близько 28 см (без розширення).

Пробірки. Для розливання води по 10 мл застосовують пробірки розміром 18 х 2,0 см; використовують також пробірки розміром 18 х 1,5 см. Для живильних середовищ використовують пробірки розміром 15 х 1,8 см.

Голки та петлі. Для взяття досліджуваного матеріалу та для посівів користуються голками та петлями.

Для миття лабораторного посуду необхіднийстіл з ванною для миття.

При роботі з мікроскопом використовуютьпредметні та покривніскло . Скло повинно бути безбарвним з рівною поверхнею, без бульбашок повітря. Для спеціальних досліджень застосовуютьпредметне скло з лунками.

1.2 Оснащення та організація роботи виробничої

Мікробіологічної (бактеріологічної) лабораторії.

Бактеріологічне дослідження продовольчої сировини та продуктів з неї проводять у спеціальній лабораторії, що має дозвіл на роботу з мікроорганізмами ІІІ-ІV груп патогенності. Мікробіологічна (бактеріологічна) лабораторія (або бакотділ у складі виробничої лабораторії м'ясопереробного підприємства) призначена для санітарно-бактеріологічного контролю сировини, готової продукції, допоміжних матеріалів, санітарно-гігієнічного стану технологічного обладнання, інвентарю, тари, одягу та рук персоналу.

Приміщення лабораторії.Загальне розміщення лабораторії та її інфраструктура повинні відповідати вимогам ГОСТ Р 51446-99 (ISO 7218-96). У лабораторії передбачаються такі окремі приміщення чи ізольовані робочі зони:

для прийому, зберігання, підготовки та обробки проб;

для проведення первинного посіву, пересівання, приготування розведень та інших робіт в асептичних умовах;

для приготування, стерилізації, розливу та зберігання поживних середовищ, підготовки лабораторного посуду та обладнання;

для знезараження та очищення обладнання, відпрацьованих поживних середовищ та контамінованих мікрофлорою матеріалів.

Термостати, холодильники, морозильники можуть бути розміщені в окремих кімнатах.

Приміщення необхідно розташовувати так, щоб забезпечити їх захист від впливу зовнішніх факторів(Підвищена температура, вологість, запиленість, шум, вібрація), організувати потоковість проходження чистих та заражених матеріалів.

М'ясо може бути обсіменене патогенною мікрофлорою, що становить серйозну небезпеку для здоров'я людей, і приміщення лабораторії мають бути ізольовані від інших відділів. Якщо немає можливості організувати окрему кімнату, допускається у спільному приміщеннівстановити стіл щодо первинного посіву проб. Доцільно обладнати засклений бокс із передбоксником для забезпечення асептичних умов роботи.

Лабораторні кімнати повинні бути світлими (освітленість поверхні столів у межах 500 лк) і просторими – для кожного аналітика рекомендована площа робочого місця близько 20 м. Стіни, стеля та підлога повинні бути гладкими, легкоочисні, стійкими до дії детергентів та дезінфікуючих речовин. Для зручності очищення та дезінфекції поверхню лабораторного інвентарю та меблів покривають гладким непроникним матеріалом, наприклад пластиком, а робоче місце – дзеркальним столом.

Для бактеріологічного аналізу харчових продуктів, зокрема ковбасних виробів та копченостей, необхідні 1-2 бокси з передбоксниками. Бокси є ізольовані, захищені від пилу засклені кімнати; максимально допустима кількість частинок розміром понад 0,5 мкм за 1м не повинна перевищувати 4000.

У приміщеннях лабораторії регулярно проводять прибирання та дезінфекцію, якість яких періодично контролюють мікробіологічним методом.

У кожному приміщенні повинні бути холодне та гаряче водопостачання, сулія з дезінфікуючим розчином для миття рук.

1.3 Правила роботи у мікробіологічній

лабораторії

Безпосередній контакт із мікроорганізмами та необхідність дотримання стерильних умов при проведенні всіх операцій потребують знання та неухильного дотримання наступних правил:

працювати у халатах;

підтримувати чистоту та порядок на робочому місці;

не торкатися пальцями мікробних нальотів та конденсаційної води в пробірках та чашках із посівами;

не прати мікробних нальотів з предметного та покривного скла та інших об'єктів серветками, фільтрувальним папером, дезінфікувати їх, поміщаючи в спирт або розчин карболової кислоти;

у процесі роботи та після проведення посівів знищувати залишки мікробних нальотів на бактеріологічних голках та петлях прожарюванням в полум'ї спиртування або газового пальника;

знешкоджувати використані забруднені матеріали та відпрацьовані культури мікробів стерилізацією в автоклаві (цю роботу виконують співробітники лабораторії);

не тримати спиртування близько до обличчя, запалювати спиртування тільки сірником;

прибрати та обробити робоче місце після закінчення роботи дезінфікуючим розчином під контролем лаборанта; помістити культури мікроорганізмів, необхідні для подальшої роботи, у холодильник або сейф, який закривають та пломбують; поставити в термостат засіяні мікрофлорою пробірки та чашки Петрі;

мити ретельно руки після закінчення роботи, не приймати їжу в лабораторії.

1.4 Пристрій оптичного мікроскопа та догляд за ним.

Мікроскоп – складний оптичний прилад, що збільшує предмет у 1000 – 1500 разів. Сучасний мікроскоп складається з двох основних частин – механічної та оптичної.

Механічна частина складається зі штатива, в якому розрізняють ніжку, основу, тубусодержатель, і предметного столика, що прикріплюється до основи штатива. Тубусоутримувач піднімається та опускається за допомогою макрометричного та мікрометричного гвинтів, призначених для грубого та точного фокусування об'єкта.

Оптична частина мікроскопа складається з освітлювального та спостережливого апаратів.

Освітлювальний апарат розташований під предметним столиком і складається з дзеркала, конденсора та ірис-діафрагми.

Дзеркало відображає світлові промені та спрямовує їх до конденсора.

Конденсор є системою лінз і служить посилення яскравості висвітлення аналізованого об'єкта.

До наглядового апарату відносять об'єктиви та окуляри.

Об'єктиви вкручуються в гнізда револьвера і складаються із системи лінз, укладених у металеву оправу. Передня або фронтальна лінза об'єктива є найменшою та єдиною, що дає збільшення. Інші лінзи в об'єктиві - корекційні.

Біологічні мікроскопи МБР-1 і МБІ-1 зазвичай мають три, чотири об'єктиви з цифровими позначеннями х8, х20, х40, х90, що показують власне збільшення цих об'єктів.

Окуляр вставляється у верхній кінець тубуса. Окуляр є системою двох плосковипуклих лінз, звернених опуклістю в бік об'єктива. Лінза, звернена до ока, називається очною, звернена до препарату – збирає. Окуляри вітчизняних мікроскопів позначаються цифрами, що показують їхнє власне збільшення: х5, х7, х10, х15.

Ступінь збільшення мікроскопа дорівнює добутку ступеня збільшення окуляра на рівень збільшення об'єктиву.

Правила догляду за мікроскопом:

Мікроскоп оберігають від попадання пилу, вологи та сонячних променів. Після роботи з ним його поміщають у футляр або накривають ковпаком із щільної тканини.

Об'єктиви та окуляри протирають замшею або фланеллю.

Тубус мікроскопа не залишають відкритим, тобто без окуляра, оскільки це призводить до накопичення пилу в тубусі та забруднення об'єктивів.

Мікроскоп складається із двох основних частин. Основою мікроскопа є штатив. До нього прикріплений тубус із укладеною в ньому оптичною частиною та предметний столик. Штатив складається з основи (або підковоподібної ніжки) та тубусоутримувача. Тубусодержатель з'єднується з основою шарніром, що дозволяє верхню частину мікроскопа встановлювати в похило положення для полегшення роботи. У тубус поміщають об'єктиви та окуляри. Об'єктиви вкручуються в нижню частину тубуса, що називається револьвером. Окуляри вільно вкладаються у верхню частину тубуса. Збільшення можна змінити шляхом застосування різних об'єктивів, які загвинчують у обертовий барабан револьвера.

Тубусоутримувач піднімається та опускається за допомогою макрометричного та мікрометричного гвинтів, призначених для грубого та точного фокусування об'єкта. Щоб препарат було ясно видно, тубус за допомогою механізмів грубого або мікрометричного руху необхідно пересувати у напрямку оптичної осі. Грубий рух має здійснюватись досить легко, але без мимовільного опускання тубуса. Для точної установки служить мікрометричний гвинт. Мікрометричний гвинт має складну конструкцію, є однією з частин мікроскопа, що найбільш легко ушкоджуються. Не можна повертати гвинт більш ніж на півоберта в той чи інший бік (після грубої установки мікроскопа). Предметний столик служить приміщення досліджуваного препарату.

Оптична частина складається з дзеркала, конденсора з діафрагмою, об'єктивів та окулярів. Дзеркало мікроскопа рухоме. При штучному світлі краще користуватися увігнутим дзеркалом, при розсіяному світлі – плоским. Дзеркало відображає світлові промені та спрямовує їх до конденсора. Конденсор застосовується для отримання сильнішого освітлення препарату. Діафрагма служить регулювання освітленості препарату. Діафрагма знаходиться між нижньою поверхнею конденсора та дзеркалом.

Об'єктиви – найважливіша частина мікроскопа, визначальна його оптичну потужність. Об'єктиви вкручуються в гнізда револьвера і складаються із системи лінз, укладених у металеву оправу. Передня або фронтальна лінза об'єктива є найменшою та єдиною, що дає збільшення. Інші лінзи в об'єктиві корекційні. Окуляри збільшують зображення, що дається об'єктивом, але не виявляють деталей досліджуваного препарату.

Об'єктиви, які при роботі потрібно занурювати в кедрова олія, називають імерсійними або занурювальними. Сухий об'єктив – це об'єктив, у якого між препаратом та лінзою знаходиться повітря. Кожен мікроскоп має сухі та іммерсійні об'єктиви. Об'єктиви із власним збільшенням 8 та 40 є сухими, об'єктив із власним збільшенням 90 – імерсійний.

Правила роботи з мікроскопом МБР-1

1. Мікроскоп зберігають у шафі для захисту від пилу, вологи та світла. Переносять мікроскоп правою рукою, тримаючись за ручку штатива, підтримують лівою знизу.
2. Приступаючи до роботи з мікроскопом окуляр, об'єктив та дзеркало протріть серветкою.
3. Встановіть мікроскоп штативом до себе предметним столиком від себе. Стосовно сидячого мікроскоп повинен бути зрушений ближче до лівого плеча. Праворуч від мікроскопа мають альбом, простий і кольорові олівці, гумка.
4. Поставте об'єктив малого збільшення в робоче положення. Для цього повертайте револьвер доти, доки потрібний об'єктивне займе серединне становище (встане над отвором столика). Коли об'єктив займає серединне положення, в револьвері спрацьовує спеціальний пристрій - клямка, при цьому чується легке клацання і револьвер фіксується. Запам'ятайте, що вивчення будь-якого об'єкта починається із малого збільшення.
5. Підніміть за допомогою макрометричного гвинта об'єктив над столиком приблизно на 1 см. Відкрийте діафрагму, підніміть конденсор до рівня предметного столика.
6. Дивлячись лівим оком в окуляр, за допомогою дзеркала наведіть світло так, щоб все поле зору було яскраво і рівномірно освітлено.
7. Покладіть на предметний столик, підготовлений препарат покривним склом догори, щоб об'єкт знаходився в центрі отвору предметного столика. За допомогою макрометричного гвинта опустіть об'єктив над препаратом на 0,2 см.
8. Дивіться в окуляр, одночасно повільно повертайте кремальєру на себе і плавно піднімайте тубус доти (0,5 см), доки у полі зору не з'явиться зображення об'єкта; обережно обертаючи мікрометричний гвинт не більше ніж на ½ або ¾ повного обороту, досягайте чіткої видимості.
9. Переходячи до розгляду об'єкта за великого збільшення, необхідно центрувати препарат, тобто. помістити цікаву частину об'єкта в центр зору зору. Для цього пересувайте препарат за допомогою препаратів або руками, поки об'єкт не займе потрібного положення. Якщо об'єкт не буде центрований, то при великому збільшенні він залишиться поза увагою.
10. Переходячи з меншого на збільшення, поворотом револьвера поставте об'єктив більшого збільшення проти нижнього отвору тубуса. Дивіться в окуляр і, обережно обертаючи мікрометричний гвинт, досягайте чіткого зображення.
11. При замальовуванні препарату дивіться в окуляр лівим оком, а правим у альбом.
12. Після роботи з використанням мікроскопа за допомогою револьвера замініть об'єктив великого збільшення об'єктивом малого, зніміть зі столика препарат і поставте його на місце.
13. Приберіть у себе робочий стіл; препарати та методичні вказівки на стіл викладача.

1.5. Основні форми бактерій.

За формою бактерії прийнято ділити на кулясті (коки), паличкоподібні (клостридії, бацили) та звивисті (вібріони, спірили, спірохети).

Кокковидні форми за розташуванням коків поділяються на мікрококи – клітини, розташовані одиночно; диплококи - коки, з'єднані по два; тетракоки - коки, з'єднані по чотири; стрептококи - коки, розташовані у вигляді довгого або короткого ланцюжка; сарцини – коки, які у вигляді пакетів; стафілококи - безладне скупчення коків, частіше у вигляді грон винограду.

Паличкоподібні форми за розташуванням паличок поділяють на диплобактерії – палички, з'єднані попарно; стрептобактерії – палички, які у вигляді ланцюжка. Серед спороутворюючих розрізняють бацили та клостридії. У бацил діаметр спор не перевищує ширини вегетативної клітини, а у клостридій – суперечки більше ширини клітини, тому клітина набуває форми веретена, тенісної ракетки, барабанної палички.

Звивисті форми поділяють на вібріони, що мають форми коми, спірили, що мають кілька (до 5) завитків, і спірохети з великою кількістюдрібних завитків.

Порядок виконання

2. Мікроскопія готових препаратів із основними формами бактерій.

Техніка мікроскопування.

На предметний столик поміщають досліджуваний препарат та закріплюють клемами.

При роботі з імерсійним об'єктивом 90 на препарат наносять краплю імерсійної олії, а потім за допомогою макрометричного гвинта обережно опускають тубус з центрованим об'єктивом 90 так, щоб його фронтальна лінза поринула в краплю олії, а фокус був нижче за препарат. Потім, дивлячись в окуляр, тим же гвинтом дуже повільно піднімають тубус (на соті частини міліметра), поки не побачать зображення мікробів. Точну установку препарату у фокус об'єктиву виробляють за допомогою мікрометричного гвинта.

Примітка.

Перевагою імерсійної системи є те, що при зануренні об'єктива в масло, промені світла, що проходять через середовище скло-масло, майже не заломлюються, оскільки показник заломлення світла для цих середовищ майже однаковий. Внаслідок цього освітленість при мікроскопуванні з маслом максимальна.

Після закінчення роботи видаляють серветкою з м'якої тканини іммерсійне масло з фронтальної лінзи об'єктива 90, для більш повного видалення масла фронтальну лінзу протирають серветкою, змоченою сумішшю спирту та ефіру в пропорції 1:1, потім протирають об'єктив насухо. Мікроскоп поміщають для зберігання.

При мікроскопуванні звернути увагу на форму і розмір клітин мікроорганізму, що вивчається, на особливості будови клітин - наявність спор і капсул у бактерій, нирок - у дріжджів; у препараті плісняв – на різноманітність форм клітин: круглі, овальні, витягнуті, циліндричні, гіллясті.

Звіт за результатами мікроскопування.

Результати мікроскопування заносяться до таблиці (форма1).

Форма 1

Контрольні питання.

1. Яким обладнанням має бути оснащена мікробіологічна лабораторія, його призначення?
2. Основні правила роботи у мікробіологічній лабораторії.
3. Яким є пристрій оптичної системи біологічного мікроскопа?
4. Яких правил необхідно дотримуватись при користуванні та догляді за мікроскопом?
5. Які основні форми бактерій ви знаєте?

Лабораторна робота № 2.

Приготування мікробіологічних препаратів для вивчення живих мікроорганізмів («роздавлена ​​крапля» та «висяча крапля»). Приготування мазків із мікробних культур.

Будь-яка робота з приготування препаратів мікроорганізмів, так само як і пересівання мікроорганізмів, проводиться з дотриманням правил асептики.

Устаткування лабораторного столу.

p align="justify"> Для роботи з мікроорганізмами потрібне певне обладнання. На робочому лабораторному столі повинні бути спиртівка або газовий пальник, бактеріологічна петля, предметне та покривне скло, набір фарб, мікроскоп, серветка, кедрова олія, пінцет, кювета з містком, посудина з водою, пісочний годинник, олівець по склу, фільтрувальний папір.

Мета заняття.

Ознайомитись з методами дослідження бактерій на рухливість.

Матеріальне забезпечення.

Молоді бульйонні культури мікроорганізмів у пробірках для дослідження на рухливість, предметне та покривне скло, предметне скло з ямочкою, бактеріологічні петлі, пастерівські піпетки, мікроскопи, сірники, спиртові або газові пальники.

Викладач має продемонструвати техніку приготування незабарвлених препаратів мікроорганізмів, підготовку мікроскопа до роботи, регулювання освітленості поля зору, встановлення збільшувача, техніку мікроскопування препаратів.

Під час роботи студентів викладачеві слід постійно перевіряти освітленість поля зору у кожному мікроскопі, у необхідних випадках допомогти відрегулювати її та подивитися зображення знайдених об'єктів. Перегляду незабарвленого препарату слід приділити особливу увагу, оскільки студенти повинні бачити тут і форму клітин та їх рухливість.

Завдання.

1. Приготувати препарати «роздавлена ​​та висяча крапля» для визначення рухливості бактерій.
2. Приготувати мазок із мікробної культури.
3. Вивчити техніку мікроскопування та подивитися приготовлені препарати під мікроскопом.
4. Скласти звіт щодо результатів мікроскопування.
5. Записати зміст заняття у робочий зошит.

Порядок виконання

1. Дослідження рухливості мікробів у препаратах «роздавлена ​​та висяча крапля».

Розчавлена ​​крапля.

Якщо організми знаходяться в рідкому середовищі, крапля суспензії наноситься на знежирене скло за допомогою стерильної піпетки. (Піпетка після вживання відразу ж поміщається у фарфорову склянку з дезінфікуючим розчином. Класти брудну піпетку на робочий стіл неприпустимо!). Якщо ж культура вирощена на твердому поживному середовищі, то на скло попередньо наносять краплю води, а потім поміщають у неї клітини мікроорганізмів або досліджувану пробу тестованого продукту бактеріологічною петлею, прожареною в полум'ї пальника, і ретельно розмішують.

Краплю рідини накривають покривним склом. Щоб під ним не утворювалися бульбашки повітря, покривне скло спочатку ставлять на предметне скло одним ребром, а потім плавно опускають, притискаючи «роздавлюючу» краплю. Бажано уникати надлишку рідини, щоб суспензія мікроорганізмів не вичавлювалася з-під покривного скла. Якщо це сталося, зайву рідину видаляють за допомогою фільтрувального паперу. Використаний папір слід відразу ж помістити в розчин, що дезінфікує.

Для мікроскопування препарату «роздавлена ​​крапля» використовують лише об'єктиви із сухою системою, тобто без імерсії. Цей вид препарату дозволяє встановити форму клітин, їх розмір, спосіб спороутворення, а якщо клітини живі, то наявність або відсутність рухливості.

Перевага препарату – виходить тонкий шар рідини, де можна побачити живі організми.

Недолік швидко висихає, і рух припиняється, часто потрапляє повітря, що порушує мікроскопічну картину.

Для приготування препаратувисяча крапля на покривне скло наносять невелику краплю суспензії мікроорганізмів, перевертають його краплею вниз і поміщають на спеціальне скло з поглибленням (лункою) в центрі. Крапля повинна вільно висіти, не торкаючись країв та дна лунки. Якщо чекають багатоденні спостереження, краї лунки змащують вазеліном і крапля виявляється герметично укладеною у вологій камері. Препарат «висяча крапля» використовують для виявлення рухливості мікроорганізмів, вивчення способів розмноження, спостереження за проростанням спор.

Для приготовленняпрепарату-мазка досліджувану культуру мікроба обережно розподіляють рівномірним тонким шаром на предметному склі. При приготуванні культур, що виросли на щільних середовищах, надходять таким чином. На чисте предметне скло стерильною піпеткою чи бактеріологічною петлею наносять краплю стерильної водопровідної води чи фізіологічного розчину.

а) Береться пробірка з культурою, з якої потрібно приготувати мазок. Бактеріологічну петлю прожарюємо в полум'ї пальника, тримаючи її у вертикальному положенні.

б) Затиснувши пробку між мізинцем і долонею правої руки, виймаємо її з пробірки і тримаємо кінцем донизу, не допускаючи зіткнення з рукою тієї частини пробки, яка була в пробірці.

в) Відкритий кінець пробірки обпалюємо на полум'ї.

г) Вводимо в пробірку петлю (ще раз проведену через полум'я), охолоджуємо дотиком до стінки пробірки і набираємо невелику кількість матеріалу, злегка торкаючись культури і не дряпаючи середовище петлею.

д) Краї пробірки та кінець ватної пробки обпалюємо над полум'ям пальника.

е) Пробірку закриваємо ватною пробкою.

ж) Взятий матеріал емульгують у краплі, що є на предметному склі, і рівномірно тонким шаром петлею розподіляють по поверхні (1,5 х 2 см).

з) Петлю прожарюють та кладуть на місце.

Якщо культура вирощена в рідкому живильному середовищі, то стерильну петлю опускають у рідину, захоплюють краплю та розтирають на предметному склі.

3.Техніка мікроскопування.

Місцять мікроскоп на робочому столі від краю на 3-5 см тубусодержателем до себе.

Встановлюють хороше рівномірне освітлення поля зору мікроскопа, навіщо, дивлячись в окуляр, дзеркалом спрямовують промінь світла джерела в об'єктив. Конденсор має бути піднятий нагору, а діафрагма відкрита. Поле зору мікроскопа має бути добре та рівномірно освітлене у всіх точках.

На предметний столик поміщають досліджуваний препарат мазком або краплею нагору і закріплюють клемами.

Незабарвлені препарати мікроскопують з об'єктивами х8 і х40, опускаючи конденсор на 1-0,5 см до препарату, досягають найкращої видимості незабарвлених клітин.

При мікроскопуванні "живих" мікробів (незабарвлений препарат) відзначити рухливість.

4.Звіт за наслідками мікроскопування.

в) малюнок клітин під мікроскопом (зазначити наявність спор, капсул, нирок, рухливість).

5. Записати зміст заняття в робочий зошит.

Контрольні питання

1. Яка техніка приготування препаратів «роздавлена ​​та висяча крапля»?
2. Яка методика приготування мазка з культури бактерій, вирощених на щільному поживному середовищі?
3. Що дозволяє встановити препарат "роздавлена ​​крапля"?
4. Для яких досліджень використовують препарат «висяча крапля»?

Лабораторна робота №3.

Приготування фарбованих препаратів бактерій.

Ціль заняття.

Навчитися готувати та фарбувати бактеріальні препарати простим методом та за методом Грама.

Матеріальне забезпечення.

Набір готових розчинів фарб у флаконах, набір сухих фарб у флаконах або в пробірках з гумовими або корковими пробками: основний та кислий фуксин, генціанвіолет, метиленовий синій, сафранін, малахітова та діамантова зелень, суміш мікробів: культури грампозитивних бактерій (Bac sub. saprophyticus), грамнегативних мікробів (E. coli), вирощених на скошеному МПА, предметне скло, розчин водного фуксину (фуксин Пфейффера), бактеріологічні петлі, фільтрувальний папір, мікроскопи, спиртові або газові пальники.

Викладач має продемонструвати техніку приготування забарвлених препаратів мікроорганізмів, підготовку мікроскопа до роботи, регулювання освітленості поля зору, встановлення збільшувача, техніку мікроскопування препаратів.

Під час роботи студентів викладачеві слід постійно перевіряти освітленість поля зору у кожному мікроскопі, у необхідних випадках допомогти відрегулювати її та подивитися зображення знайдених об'єктів. При перегляді забарвленого препарату студент повинен бачити наявність спор та капсул у мікроорганізмів.

Завдання.

1. Приготувати мазок із зубного нальоту та пофарбувати простим методом.
2. На одному предметному склі приготувати мазок із суміші стафілокока та кишкової палички та пофарбувати за Грамом.
3. Переглянути з імерсійним об'єктивом пофарбовані мазки.
4. Записати зміст заняття у робочий зошит.

Відповісти на контрольні питання.

Пояснення до роботи

Для вивчення форми мікробної клітини та деяких її структур препарат (мазок) із матеріалу, що містить досліджуваний мікроб, фарбують.

Більшість мікробів швидко та добре забарвлюються розчинами анілінових барвників. за хімічним властивостямїх прийнято ділити на основні та кислі. У основних барвників хромофором (іон, що надає фарбування) є катіон, у кислих - аніон.

До основних барвників відносяться червоні - нейтральний червоний, основний фуксин, сафранін, тіонін, піронін, гематоксилін; сині – метиленовий синій; фіолетові – кристалічний фіолетовий, метиленовий фіолетовий; зелені – малахітовий зелений, метиленовий зелений. Основні барвники, зазвичай, легко зв'язуються з ядерними (кислими) компонентами клітин.

До кислих барвників відносяться червоні та рожеві - кислий фуксин, еозин; жовті – пікринова кислота, конго, флуоресцен; чорні – нігрозин. Кислі барвники інтенсивніше фарбують (основні) компоненти клітин.

Приготування робочих розчинів фарб.Перш ніж приготувати робочі розчини фарб, призначені для фарбування мікробів, часто заздалегідь із сухих фарб, призначені для фарбування мікробів, часто заздалегідь із сухих фарб готують насичені спиртові розчини. Для цього фарбу заливають 96%-ним спиртом у співвідношенні 1:10. При такому співвідношенні спирт насичується фарбою (нерозчинена частина фарб випаде в осад). З метою економії рекомендується брати на 100 см ? спирту метиленового синього 7,0, генціанвіолета 4,8, основного фуксину 8,1.

Для кращого насичення спиртові розчини поміщають термостат і витримують до повного розчинення фарб. З насичених спиртових розчинів у разі потреби готують водні робочі розчини.

Найчастіше вживають такі розчини барвників:

Карболовий розчин фуксину Цилю.До 100 мл 5% розчину кристалічної карболової кислоти додають 10 мл насиченого спиртового розчину фуксину основного. Насичений розчин фуксину одержують при змішуванні 8 г кристалів фуксину 10 мл спирту. Фарба має червоний колір.

Фуксін Пфейфферає карболовий розчин фуксину Циля, розведений у дистильованій воді 1:10. Готується безпосередньо перед використанням. Фарба має насичений рожевий колір.

Карболовий розчин генціанвіолету.До 10 мл насиченого спиртового розчину фарби додають 100 мл 2% водного розчину карболової кислоти. Насичений розчин одержують, розчиняючи 1г кристалічного генціанвіолету в 10 мл 96%-ного спирту. Фарба має синьо-фіолетовий колір.

Сафранін. Готують безпосередньо перед використанням, додаючи до 100 мл гарячої води 1г сафраніна. Фарба має червоно-коричневий колір.

Метиленова синя (синька Леффлера).Готують, додаючи до 100 мл дистильованої води 30 мл насиченого спиртового розчину фарби і 1 мл 1% водного розчину КОН або NaOH. Розчин має темно-синій колір.

Малахітова зелень.1 г фарби розчиняють у 100 мл дистильованої води, фільтрують. Розчин має синьо-зелений колір.

Розчин Люголю. Беруть 1г кристалічного йоду та 2г йодистого калію на 300 мл дистильованої води. Спочатку у невеликій кількості води розчиняють йодистий калій, а потім додають кристали йоду. Після повного розчинення додають решту дистильованої води.

Складні способи фарбуваннязастосовують для детального вивчення структури клітини, і навіть для диференціації одних мікроорганізмів з інших. Складні методи фарбування ґрунтуються на особливостях фізико-хімічної будови клітини та її частин. Найбільше практичне знання має забарвлення за Грамом, що дозволяє диференціювати бактерії за хімічним складом та структурою клітинної стінки.

Метод був розроблений датським ученим Християном Грамом в 1885 р. При забарвленні методом Грама всі бактерії діляться на дві групи: грампозитивні і грамнегативні.

Порядок виконання

Методика фарбування за Грамом.

1.Метод простого забарвлення.При простому методіЗабарвлення використовується один який-небудь барвник, найчастіше фуксин Пфейффера або метиленовий синій.

На фіксований препарат поміщають піпеткою кілька крапель барвника так, щоб покрити всю поверхню мазка: фуксин Пфейффера на 1-2 хв, метиленовий синій на 3-5 хв. Потім фарбу змивають водою, а мазок просушують між листочками фільтрувального паперу або на повітрі.

2.Складні методи фарбуваннязастосовують з метою діагностики, виявлення відмінних структур мікробів у випадках, коли останні не фарбуються простим способом.

Для диференціації мікробних клітин, що відрізняються хімічним складом та структурою клітинних стінок, використовується складний метод забарвлення - забарвлення за Грамом.

За фарбуванням за Грамом всі бактерії діляться на дві групи: грампозитивні та грамнегативні.

У грампозитивних бактерій (Г+) товщина клітинної стінки становить 15-80 нм, складається з пептидоглікану (від 60-90%), розташованого в кілька шарів, білка (близько 1%) та ліпідів (близько 1%). Виявлено полімери особливого типу – тейхоєві кислоти, ковалентно пов'язані з пептидогліканом. Великий вміст пептидоглікану забезпечує при фарбуванні за Грамом освіту комплексу з генціановим фіолетовим і йодом, стійкого до спирту, внаслідок чого вони пофарбовані в синьо-фіолетовий колір.

Товщина клітинної стінки грамнегативних бактерій (Г-) 10-15 нм, але структура її значно складніша, ніж у грампозитивних бактерій. Основу її складають орієнтовані внутрішні ліпіди (10-20%), які з поверхнево розташованими полісахаридами утворюють ліпополісахаридний шар. На поверхні клітинної стінки мозаїчно розташовані білки та полісахариди. Пептидоглікан представлений одним шаром завтовшки всього 2-3 нм (близько 5-10%), лежить під ліпополісахаридним шаром і щільно прикриває протопласт. Через більший вміст ліпідів клітинна стінка грамнегативних бактерій при фарбуванні за Грамом утворює з генціановим фіолетовим та йодом комплекс, що руйнується при обробці спиртом, внаслідок чого клітини знебарвлюються.

Неоднакове відношення мікроорганізмів до забарвлення за Грамом пов'язане з відмінностями в структурі та хімічному складі клітинної стінки бактерій.

До грампозитивних мікроорганізмів належать коки, бацили (спороутворюючі палички), актиноміцети, мікобактерії, клостридіальні бактерії.

До грамнегативних мікроорганізмів належать: бактерії (неспороутворюючі палички), спірили, сальмонели, E coli, псевдомонади, азотбактер, вібріони.

Є грамваріабельні мікроорганізми, відношення яких до забарвлення за Грамом змінюється на певних етапах їх життєвого циклу. Так як здатність клітин забарвлюватися за Грамом залежить від їх віку, для фарбування за Грамом використовують клітини молодої культури, частіше однодобової. Для порівняння одночасно з об'єктом, що визначається, доцільно забарвлювати клітини мікроорганізмів, відношення яких до забарвлення за Грамом відомо (контроль).

Забарвлення за Грамом здійснюють наступним чином:

1. Готують на предметному склі три мазки культури мікроорганізмів: у центрі – мазок досліджуваної культури, ліворуч та праворуч – мазки контрольних мікроорганізмів.

Мазки повинні бути тонкими, щоб клітини були рівномірно розподілені по поверхні скла і не утворювали скупчень, тому що від товщини мазка можуть залежати результати фарбування. Висушують мазки на повітрі, фіксують над полум'ям пальника.

1. Фарбують мазки карболовим генціановим фіолетовим. На мазки наносять достатньо барвника, витримують 1-2 хв, барвник зливають і, не змиваючи водою, мазки обробляють розчином Люголя до почорніння (приблизно 1-2 хв).
2. Зливають розчин Люголя і обробляють препарат 0,5-1 хв (строго) 96%-ним етиловим спиртом шляхом занурення в склянку зі спиртом або шляхом нанесення спирту на мазки (від часу обробки мазка спиртом залежить результат всього фарбування: при недостатній обробці всі бактерії зберігають фарбування, при надмірній – знебарвлюються).
3. Препарат негайно промивають водою та фарбують його 1-2 хв водним фуксином. Зливають барвник, препарат промивають водою, висушують фільтрувальним папером.
4. Мікроскопують препарат із імерсійною системою. Грампозитивні бактерії забарвлюють у темно-фіолетовий колір, грамнегативні – у червоний або рожевий колір фуксину (колір додаткового барвника).

Експрес-метод визначення грам-типу мікроорганізмів (за Крегенсеном).

Метод заснований на руйнуванні клітин грамнегативних бактерій у лужному середовищі та визначенні вільної ДНК.

На предметне скло наносять краплю 3%-ного розчину КОН, в яку вносять бактеріальною петлею досліджувані бактерії (24-годинна культура зі скошеного агару) і добре перемішують петлею.

Через 5-10 с при пересуванні петлі по склу при позитивній реакції в результаті тестування грамнегативних бактерій утворюється слизовий слід довжиною 1-2 см. Якщо слиз не утворюється, реакція негативна, тоді тестується грампозитивна культура.

3. Звіт про результати мікроскопування.

а) система мікроскопування;

б) мікроскопована культура;

в) малюнок клітин під мікроскопом (зазначити наявність спор, капсул).

4. Записати зміст заняття у робочий зошит.

Контрольні питання

1. Які розчини барвників використовують за найпростішого методу забарвлення?
2. Опишіть методику фарбування бактерій за Грамом.
3. Чому бактерії по-різному сприймають забарвлення методом Грама?
4. Які бактерії відносяться до грампозитивних, а які до грамнегативних?

ЛАБОРАТОРНА РОБОТА №4

Поживні середовища та техніка їх приготування.

Ціль заняття.

Опанувати техніку приготування поживних середовищ.

Матеріальне забезпечення.

Сухі живильні середовища, середовища, готові до вживання, електроплитка, посуд для варіння середовищ, індикаторний папір, 20% їдкий натр, 20% соляна кислота, пробірки, піпетки, чашки Петрі.

Перед виконанням роботи студенти повторюють питання харчування мікроорганізмів, живильні середовища, класифікацію поживних середовищ, основні вимоги до живильних середовищ.

За виконання лабораторної роботи студенти готують живильне середовище.

Завдання.

1. Ознайомитись із поясненням до роботи.
2. Приготувати живильне середовище (за завданням викладача).
3. Записати зміст заняття у робочий зошит.

Відповісти на контрольні питання.

Пояснення до роботи

У бактеріологічних лабораторіях не можна уникнути поживних середовищ. Для визначення виду мікроорганізму, виявлення збудника інфекційної хвороби, тобто встановлення діагнозу захворювання, виробництва специфічних препаратів (вакцин, сироваток), для лікування та профілактики інфекційних хвороб, отримання антибіотиків, санітарно-мікробіологічних досліджень об'єктів зовнішнього середовища, бактеріологічного дослідження м'яса та м'яса продуктів вдаються до штучного вирощування мікроорганізмів на живильних середовищах.

У лабораторіях культивують мікроорганізми in vitro, тобто. у скляних пробірках, колбах чи інших судинах. Для культивування in vitro необхідні субстрати, які мікроорганізми використовують як поживні речовини.

За потребою у поживних речовинах усі мікроорганізми можна поділити на три групи:

перша група - невибагливі, що ростуть на простих середовищах (гнильні, більшість кокових та інших мікроорганізмів);

друга група - що вимагають для свого зростання додаткових поживних речовин: повноцінного білка (курячого або сироваткового), вітамінів, певного набору амінокислот, мікроелементів (туберкульозна, туляремійна палички, лептоспіри та ін.);

третя група – що не ростуть на штучних живильних середовищах, а здатні розмножуватися тільки всередині живих клітин (віруси, рикетсії).

До живильних середовищ висувають такі вимоги:

1. Вони повинні містити джерела азоту та вуглецю, неорганічні сполуки, мікроелементи, а також фактори росту, вітаміни, переважно групи В.

Як універсальне джерело азоту використовують пептони. Пептони – це продукти гідролізного розщеплення м'яса чи казеїну. У них містяться поліпептиди, амінокислоти та основні мінеральні речовини.

Як універсальне джерело вуглецю в поживні середовища додають вуглеводи (цукри) - глюкозу, лактозу, сахарозу, органічні кислоти - молочну, лимонну та ін., багатоатомні спирти- маніт, гліцерин, сорбіт та ін.

2. Поживні середовища повинні мати певну реакцію середовища. Так, для більшості кокових, гнильних та патогенних мікроорганізмів оптимум рН 7,0…7,4, а плісняві гриби, дріжджі, молочнокислі мікроорганізми краще розвиваються при рН 6,0.

3. Поживне середовище має бути стерильним, тобто. не містити мікроорганізмів.

4. Поживне середовище має бути вологим, оскільки харчування у мікроорганізмів здійснюється за законами дифузії та осмосу. Багато середовищ мають бути прозорими для того, щоб можна було розрізнити на них зростання мікроорганізмів і спостерігати за фізіологічними змінами, що відбуваються внаслідок їхньої життєдіяльності.

По консистенції живильні середовища бувають рідкі, напіврідкі та щільні. Для приготування щільних середовищ в рідкі середовища додають агар-агар 2...3% концентрації, для напіврідкої - агар-агар 0,2...0,3% концентрації.

За походженням розрізняють середовища природні та штучні.

Природні живильні середовищає продуктами тваринного походження (кров, сироватка крові, молоко, жовч…) або рослинного походження (овочі, фрукти, злакові), які використовують для культивування мікроорганізмів без спеціальної обробки з повним збереженням їх природних властивостей.

Штучні живильні середовищаготують із продуктів переробки рослин, м'яса, молока, печінки та ін., часто з додаванням до них вуглеводів, кухонної солі, фарб тощо.

Серед штучних середовищ виділяють синтетичні середовища, тобто. середовища з відомим хімічним складом. Штучні живильні середовища поділяються на прості, чи звичайні, і складні.

Прості поживні середовища служать культивування більшості мікроорганізмів. Білковою основою всіх середовищ є поживний бульйон. Зазвичай користуються двома способами приготування основного поживного бульйону: на м'ясній воді з додаванням готового пептону - м'ясопептонний бульйон, на переварах продуктів гідролізу вихідної сировини за допомогою ферментів (трипсину - бульйон Хоттінгера, пепсину - бульйон Мартена) або кислот, такі середовища багатше амінокислот.

Від азотистого складу м'ясопептонних середовищ та від ступеня розщеплення білка в м'ясних та інших гідролізатах залежить вміст у середовищі загального та амінного азоту.

Для хорошого зростання більшості мікроорганізмів необхідно вміст 100 см бульйону не менше 250 ... 300 мг загального азоту за наявності в цьому кількості амінного азоту (амінокислот) в середньому близько 25 ... 30%.

Найбільш поширеними простими поживними середовищами є м'ясо-пептонний бульйон (МПБ), м'ясо-пептонний агар (МПА), м'ясо-пептонний желатин (МПЗ).

М'ясопептонний агар (МПА) використовують для визначення загальної кількості мікроорганізмів.

Основою для всіх трьох середовищ є м'ясна вода, яку готують з фаршу яловичини, залитого водою та звареного протягом 1,5...2 годин, профільтрованого та простерилізованого протягом 20...30 хвилин при 120˚С.

М'ясо-пептонний бульйон.До 1л м'ясної води додають 1% пептону і 0,5% кухонної солі, підлужують 10% розчином NaOH до рН 7,4, фільтрують і стерилізують протягом 15 ... 20 хв при тиску 0,1 МПа.

М'ясо-пептонний агар.До м'ясо-пептонного бульйону додають дрібно подрібнений агар-агар (2...3%), нагрівають суміш до розплавлення агару, встановлюють рН до 7,2...7,6, фільтрують через ватно-марлевий фільтр, розливають по пробірках і колбам стерилізують протягом 20 ... 30 хв при 120?

При необхідності МПА розігрівають на водяній бані до розплавлення. Пробірки укладають у спеціальні штативи під кутом 10 і після застигання отримують так званий скошений агар, який використовують для посівів мікроорганізмів. Розплавлений м'ясо-пептонний агар розливають також у чашки Петрі.

Аналогічно готують м'ясо-пептонний желатин.

Порядок виконання

2. Приготування живильного середовища з готового сухого живильного середовища.

Сухі живильні середовища.Випускаються прості, елективні та диференційно-діагностичні сухі живильні середовища. Сухі живильні середовища є гігроскопічні порошки, що легко розчиняються у воді. Сухі живильні середовища випускаються в скляних банках з кришками, що щільно загвинчуються.

Такі середовища готують згідно з інструкцією, розчиняючи порошок у зазначеній кількості дистильованої води, фільтрують і стерилізують при температурі 120С протягом 20 хв.

Сухий живильний агарготують наступним чином: до розчиненого сухого агару (5 г агару на 100 мл) додають як фактори росту невелику кількість дріжджового екстракту, м'ясної води, фільтрують через ватно-марлевий фільтр, розливають у пробірки або флакони і стерилізують при 0,1 МПа протягом 20 хв.

3. Записати зміст заняття у робочий зошит.

Контрольні питання

1. Які основні вимоги до живильних середовищ?
2. Які найбільш уживані поживні середовища, призначені для культивування мікроорганізмів, їх призначення?
3. Які компоненти входять до складу простих поживних середовищ?

Список використаної літератури

1. Градова Н. Б. Лабораторний практикум із загальної мікробіології - М.: ДеЛі принт, 2010.
2. Мармузова Л. В. Основи мікробіології, санітарії та гігієни в харчовій промисловості - М.: 2005.
3. Мудрецова-Вісс К. А. Мікробіологія, санітарія та гігієна - М.: ДЛ, 2010.

«Основи мікробіології, санітарії та гігієни».

МЕТОДИЧНІ ВКАЗІВКИ

до лабораторних робіт №№1-4

для учнів професії НУО

34.17 Оператор ковбасного виробництва.

__________________________________________________________________

Жукова Любов Анатоліївна, викладач спеціальних дисциплін ДАОУ СПО міста Москви ТК №28

Державний автономний освітній заклад

середньої професійної освіти міста Москви

Технологічний коледж №28

Адреса: Москва, вул. Верхні поля, 27

Здано до друку 07.02.2012.

Формат паперу 60х90/16

Тираж 16 екз.

Надруковано в друкарні:

Державний автономний освітній заклад

середньої професійної освіти міста Москви

ФЕДЕРАЛЬНЕ АГЕНТСТВО З ОСВІТИ

КАРАЧАЄВО-ЧЕРКЕССЬКА ДЕРЖАВНА ТЕХНОЛОГІЧНА АКАДЕМІЯ

Кафедра технології виробництва продуктів тваринництва

МІКРОБІОЛОГІЯ

МЕТОДИЧНІ ВКАЗІВКИ

до лабораторних та практичних занять студентам

аграрного інституту

Черкеськ – 2010

Складені на основі зразкової та робочої програмиза курсом «Мікробіологія» відповідно до Державного освітнього стандарту вищої професійної освіти за спеціальністю 110305 «Технологія виробництва та переробки сільськогосподарської продукції» та 110201 «Агрономія» (2000 р.).

Обговорено на засіданні кафедри ТППЗ (протокол від 2.07.2009 р.)

Затверджено методичною комісією Аграрного інституту (протокол №6 від 01.01.2001 р.). Опубліковано за рішенням навчально-методичної ради Карачаєво-Черкеської державної технологічної академії (протокол від 01.01.2001р.)

Укладачі:кандидат біологічних наук, доцент , кандидат сільськогосподарських наук, доцент , помічник

Рецензенти: – кандидат біологічних наук

доцент кафедри «Агрономія»

доцент кафедри «ТППЗ»

Редактор: к. с.-г. наук, доцент
Зміст

Вступ……………………………………………………………………….. 6

1. Мікроскопія……………………………………………………………….. 7

1.1.Світлопольна мікроскопія……………………………………………. .7

1.1.1. Пристрій мікроскопа……………………………………………… 7

2. Робота з мікроорганізмами ………………………………………………. 8

2.1.Методи приготування препаратів…………………………………..... 8

2.1.1.Техніка взяття культури для препаратів…………………………… 8

2.1.2. Дослідження живих клітин мікроорганізмів методом роз-

тискової краплі……………………………………………………….. 8

2.1.3. Фіксовані препарати мікроорганізмів……………………… 9

Освітлювальна система знаходиться під предметним столиком. Дзеркало відображає світло, що падає на нього, в конденсор. Одна сторона дзеркала плоска, інша увігнута. При роботі з конденсором потрібно скористатися плоским дзеркалом. Увігнуте дзеркало застосовують під час роботи без конденсора з об'єктивами малих збільшення. Конденсор складається з 2-3 короткофокусних лінз, збирає промені, що йдуть від дзеркала і спрямовує їх на об'єкт. Конденсор необхідний під час роботи з імерсійними системами. У конденсорі є ірисова (пелюсткова) діафрагма, що складається із сталевих серпоподібних пластинок.

Забарвлені препарати розглядають при майже повністю відкритій діафрагмі, незабарвлені – при зменшеному отворі діафрагми.

Об'єктив– багатолінзова система, від якості якої залежить зображення об'єкта. Зовнішня лінза називається фронтальною, вона забезпечує збільшення. Інші лінзи виконують функції корекції оптичних недоліків.

Об'єктиви бувають сухі та занурені (імерсійні). Працюючи з сухими об'єктивами між фронтальної лінзою об'єктива і об'єктом дослідження перебуває повітря. Працюючи з іммерсійним об'єктивом V=90х між покривним склом і лінзами об'єктива перебуває кедрове масло, показник заломлення якого близький до показника заломлення скла 1,515 і 1,52 відповідно. Об'єктиви мають збільшення 8х, 40х та 90х.

Окулярслужить безпосереднім продовженням «лінз» (кришталиків) очей людини.

Окуляр складається з двох лінз – верхньої – очної та нижньої – збірної, укладених у металеву оправу. Призначення окуляра – збільшення зображення, яке дає об'єктив. Збільшення окуляра вигравірувано з його оправі. Робоче збільшення окулярів не більше від 4х до 15х.

Окуляри бувають різних типів, і вибір залежить від об'єктива. При тривалій роботі з мікроскопом користуються бінокулярною насадкою, оскільки вона покращує видимість об'єкта, знижує яскравість зображення і тим самим зберігає зір.

Робота з мікроорганізмами

2.1. Методи приготування препаратів

2.1.1. Техніка взяття культури для препаратів

Обпаленої в полум'ї бактеріологічною голкою із пробірки беруть невелику кількість мікробної маси. Якщо культура рідка, краще для цього користуватися петлею, в інших випадках - голкою.

2.1.2. Дослідження живих клітин мікроорганізмів методом розчавленої краплі

Досліджують живі клітини мікроорганізмів методом розчавленої краплі, попередньо проводять фарбування об'єкта прижиттєвими барвниками. вітальне забарвлення(барвники: метиленовий синій, нейтральний червоний у концентраціях від 0,001 до 0,0001%).

Препарати мікроскопують, трохи затемняючи поле зору; конденсор трохи опускають, надходження світла регулюють увігнутим дзеркалом. Спочатку користуються малим збільшенням - об'єктив 8х, після того, як виявляють край краплі, встановлюють об'єктив 40х або імерсійний (90х).

У разі використання методу розчавленої краплі на предметне чисте скло наносять краплю водопровідної води. До неї вносять культуру та змішують із водою. Надлишок води видаляють фільтрувальним папером. При використанні імерсійного об'єктива на предметне скло наносять краплю кедрової олії та мікроскопують.

2.1.3. Фіксовані препарати мікроорганізмів

Фіксовані препарати передбачають таку обробку живих клітин, яка дає можливість швидко перервати перебіг життєвих процесів в об'єкті, зберігши його тонку структуру. Внаслідок фіксації клітини міцно прикріплюються до скла і краще фарбуються. Фіксація необхідна у разі роботи з патогенними мікроорганізмами (з метою безпеки).

Приготування мазка.На чисте знежирене предметне скло наносять краплю водопровідної води. Для знежирення скла використовують суміш етилового спирту та сірчаного ефіру у співвідношенні 1:1. Прожареною бактеріологічною голкою з пробірки з культурою беруть невелику кількість мікробної маси та вносять у краплю води. Краплю ретельно розмазують петлею по склу на площі близько 4 см2.

Якщо густа суспензія, її спочатку розводять водою. Для цього прожареною петлею беруть трохи суспензії та переносять у краплю води на інше предметне скло. Суспензію нормальної густоти розмазують тонким шаром по склу, потім сушать мазок на повітрі при кімнатній температурі або при слабкому нагріванні, тримаючи препарат високо над полум'ям пальника. Сильне нагрівання препарату при сушінні не рекомендується для уникнення коагуляції білків, що спотворює структуру та форму клітин. Висушений препарат фіксують.

Фіксація мазка.Її проводять над полум'ям пальникаабо за допомогою хімічних соєднань.У першому випадку препарат три-чотири рази повільно проводять нижньою стороною над полум'ям пальника, у другому випадку використовують хромові сполуки: формалін, осмієву кислоту, ацетон. Один із поширених прийомів фіксації – обробка препарату 96%-ним спиртом або сумішшю рівних обсягів етилового спирту та ефіру (рідина Никифорова). Для цього препарати занурюють на 10-30 хв фіксуючу рідину.

Фарбування препарату.На мазок наносять кілька крапель барвника. Залежно від виду барвника та мети дослідження тривалість фарбування варіює від 1 до 5 хв, в окремих випадках займаючи до 30 хв. Після закінчення фарбування препарат промивають водою, фільтрувальним папером видаляють воду, підсушують на повітрі та мікроскопують.

Існують прості та диференційовані методи забарвлення.

При простийзабарвленні використовують якийсь один барвник (метиленовий синій, фуксин, генціан фіолетовий), фарбується вся клітина.

При диференційованоюЗабарвленні окремі структури клітини забарвлюються різними барвниками (забарвлення за Грамом, забарвлення спор).

Дослідження морфології мікроорганізмів

3.1. Форма клітин

3.1.1. Бактерії

За формою всі бактерії ділять на кулясті (коки), паличкоподібні та звивисті.

Кулясті бактерії - коки.

1. Мікрококи –одиночні кулясті клітини ( Micrococcus agilis).

2. Диплококи –кулясті коки, з'єднані по двоє. ( Azotobacter chroococcum).

3. Тетракоки- кулясті коки, з'єднані по чотири.

4.Стрептококи- кулясті бактерії, з'єднані в ланцюжки (в основному відносяться патогенні, а також молочнокислі бактерії Lactococcus lactis).

5. Сарцини- кулясті бактерії, що групуються по 8 клітин, виникають в результаті поділу клітини в трьох взаємно перпендикулярних площинах. Деякі види сарцинів формують великі кубоподібні пакети, в яких з кожного боку знаходиться по 4 сарцини. Типовий представник Sarcina flava(Сарцина жовта) - найбільш поширений представник мікрофлори повітря.

Усі кулясті форми бактерій, за винятком Streptoctococcus lactis, переглядають на фіксованих та пофарбованих фуксином препаратах.

Паличкоподібні бактерії. До них відносять форми, що не утворюють суперечки. Pseudomonas, Achromobacter, Lactobacillusта ін) та утворюючі суперечки (пологи Bacillus, Clostridiumта ін.).

Неспоротворна паличка Pseudomonas stutzeri – цитоплазма її фарбується рівномірно.

Спороутворюючі палички Bacillus mycoidesі Bacillus mesentericus.Під мікроскопом виглядають нерівномірно забарвленими. Суперечки не забарвлюються, як щільніші структури. Клітини Bacillus mycoidesрозташовуються ланцюжками, це стрептобацили.

Паличкоподібні бактерії переглядають на фіксованих та пофарбованих препаратах.

Звивисті форми

1. Вібріони – злегка вигнуті клітини.

2. Спірили можуть мати один завиток у вигляді російської літери С, два завитки у вигляді латинської літери S або кілька - у вигляді спіралі.

3. Спірохети - довгі та тонкі клітини з великою кількістю завитків; довжина клітин перевищує їхню товщину в 5-200 разів.

Вібріони та спірили зручно переглядати на фіксованому та пофарбованому препараті, приготовленому з гноївки, попередньо інкубованої протягом кількох діб у термостаті. З багатьох мікроорганізмів на такому препараті часто зустрічаються звивисті форми.

Зі спірохетами можна познайомитися на фіксованому забарвленому препараті зубного нальоту, особливо вдалі препарати зіскрібка з карієсного зуба. Зубні спірохети дуже тонкі, волосоподібні, короткі (всього 2-3 завитки).

3.1.2. Актиноміцети

Актиноміцети – променисті гриби. Міцелій актиноміцетів на живильних середовищах диференційований: одна частина його занурена в субстрат (субстратний міцелій), інша знаходиться над субстратом (повітряний міцелій).

Багато представників актиноміцетів продукують пігменти, тому їхній повітряний міцелій і особливо колонії пофарбовані в блакитний, синій, фіолетовий, рожевий, бурий, коричневий або чорний кольори. Актиноміцети забарвлюють живильне середовище у відповідні кольори.

На предметне скло наносять шматочок колонії актиноміцету разом із середовищем. Другим предметним склом щільно притискають цей шматочок до скла, роздавлюють та розмазують по склу. Препарат сушать, фіксують, фарбують, проглядають під мікроскопом, де частково проглядаються міцеліальні одноклітинні нитки.

3.1.3. Дріжджі

Дріжджі – одноклітинні мікроскопічні гриби різноманітні за формою: еліпсоподібна, грушоподібна, округла, циліндрична. Розмножуються вегетативним та статевим шляхом.

Для лабораторних занять використовують пекарські дріжджі. Невеликий шматочок дріжджової маси за кілька годин до занять поміщають у теплу підцукровану воду та ставлять у тепле місце. Утворюється білувата каламутна рідина. Краплю цієї рідини наносять на предметне скло, накривають покривним склом, зверху наносять краплю кедрової олії та переглядають препарат з імерсійною системою. Видно клітини, що ниркуються і діляться.

3.2. Хімічні методи дослідження

3.2.1. Забарвлення клітин мікроорганізмів за Грамом

Цей метод диференціації мікробних клітин заснований на відмінності у хімічному складі клітинних оболонок. У клітинах одних видів мікроорганізмів утворюється нерозчинна в спирті сполука йоду з основним барвником, а в інших видів ця сполука з'являється тимчасово і після обробки спиртом розчиняється. Мікроорганізмів першої групи називають грампозитивними другий - грамнегативними.

Техніка фарбування за Грамом.На знежирене предметне скло наносять три тонкі мазки різних культур мікроорганізмів (два з них - контрольні, із відомим ставленням до забарвлення за Грамом). Мазки висушують на повітрі, фіксують над полум'ям пальника і забарвлюють протягом 1 хв феноловим розчином фіолетового генціану (або кристалічного фіолетового), тримаючи скло в злегка похилому положенні. Потім барвник зливають і, не промиваючи препарат водою, наносять на нього на 1 хв. розчин Люголя (до повного почорніння мазка). Скло тримають у похилому положенні. Препарат, не промиваючи водою, обробляють, безперервно похитуючи, 96% спиртом протягом 15-20 с. Важливо дотримуватися часу знебарвлення, тому що при перевищенні зазначеного терміну знебарвлюються і грампозитивні клітини.

Промиваючи водою, препарат фарбують фуксином Пфейфера протягом 1 хв. Грампозитивні мікроорганізми набувають темно-фіолетового кольору, а грамнегативні забарвлюються в колір додаткового забарвлення (фуксину).

Результати забарвлення за Грамом залежать від віку культури: у старих культурах мертві клітини завжди забарвлюються грамнегативно. Тому краще використати молоді однодобові культури.

Хорошими об'єктами для фарбування клітин мікроорганізмів за Грамом служать дріжджі, Bacillus mesentericusабо Bacillus subtilis(грампозитивні) та кишкова паличка Escherichia coli (грамнегативна).

Барвники та реактиви для фарбування за Грамом.

1. Феноловий розчин генціану фіолетового:генціан фіолетовий – 1 г, спирт 96%-ний – 10 мл, фенол кристалічний – 2 г, вода дистильована – 100 мл.

У деяких випадках застосовують спиртовий розчин генціануфіолетового:генціан фіолетовий (або кристалічний фіолетовий) – 1 г, спирт 96%-ний (ректифікат) – 100 мл, гліцерин – 5 мл. Суміш ставлять термостат на 24 год, потім фільтрують.

2. Розчин Люголю(йодит калію – 2 г, йод кристалічний – 1 г, вода дистильована – 300 мл). Спочатку готують концентрований розчин йодиту калію в 5 мл води, у ньому розчиняють йод, потім додають воду до 300 мл.

3. Спирт 96%-ний.

4. Фуксин Пфейфера(водний розчин карболового фуксину Цилю): 1 мл карболового фуксину Цилю та 9 мл дистильованої води. Готують його так: 1 г фуксину, 5 г кристалічного фенолу, 96 % спирт – 10 мл, кілька крапель гліцерину, 100 мл дистильованої води, фуксин розчиняють в етанолі, додають розчинений у воді фенол. Розчин перемішують та залишають на кілька днів. Перед використанням фільтрують.

3.2.2. Забарвлення спор у бактерій

Суперечки бактерій порівняно з вегетативними клітинами мають високу стійкість до несприятливих умов зовнішнього середовища. Вони є округлі, овальні або еліпсоподібні утворення. Якщо діаметр суперечки не перевищує діаметра клітини, в якій суперечка утворюється, клітину називають бацилярної, якщо перевищує, то залежно від розташування спори в центрі або на кінці клітини цю клітину називають відповідно клостридіальної або плектридіальної . У бацилярній клітині спору може розміщуватися в центрі клітини - центральнестановище, на кінці - термінальнеі ближче до одного з кінців - субтермінальнестановище.

При спостереженні за живими бактеріями спороутворюючими їх суперечки можна розрізнити по більш сильному заломленню світлових променів. Суперечки кислотостійкі, тому важко офарблюються барвниками. Пояснюється це великою щільністю оболонки, низькою концентрацією у ній вільної води та високим вмістом ліпідів у суперечках. У препаратах, пофарбованих простими способамиабо за Грамом, суперечки залишаються безбарвними (Негативне забарвлення).

Всі способи забарвлення спір засновані на єдиному принципіСпершу спори протруюють різними речовинами: хромовою, соляною, сірчаною, оцтовою кислотами, аміаком, їдким натром або перекисом водню, потім забарвлюють клітину зі спорою при нагріванні і, нарешті, знебарвлюють цитоплазму і додатково забарвлюють її контрастним барвником.

Метод Ціля-Нільсена у модифікації Мюллера.До фіксації мазка бактерій на полум'ї готують звичайним способом. Далі на фіксований в полум'ї і остиглий препарат наносять 5% розчин хромової кислоти. Через 5-10 хв її змивають водою. Препарат накривають смужкою фільтрувального паперу та рясно змочують папір карболовим фуксином Цилю. Підігрівають препарат над полум'ям до появи пари (не до кипіння), потім відводять його убік і додають нову порцію барвника. Цю процедуру проводять протягом 7 хв. Важливо, щоб барвник випаровувався, але папір не підсихав. Після охолодження її знімають, препарат промивають водою і ретельно промокають фільтрувальним папером. Внаслідок такої обробки клітини зі спорами рівномірно фарбуються.

Далі знебарвлюють цитоплазму клітин (але не суперечки), обробляючи 1%-ним розчином соляної або сірчаної кислоти протягом 15-30 с. При приготуванні препарату спір Bacillus mycoidesабо Bacillus mesentericusрекомендується знебарвлювати цитоплазму 16-18 с (розмірно рахуючи вголос від 21 до 37-40). При перевищенні цього часу можуть знебарвитися і суперечки. Потім препарат промивають водою та фарбують метиленовим синім 2 хв.

Забарвлення виходить контрастним та яскраво-червоні суперечки чітко виділяються на блакитному тлі цитоплазми.

Метод Пєшкова.На фіксований в полум'ї препарат наливають метиленовий синій Леффлер, доводять його до кипіння і кип'ятять 15-20 с, тримаючи скло над полум'ям. Мазок промивають водою і дофарбовують протягом 30 з 0,5%-ним водним розчином нейтрального червоного. Ще раз промивають, підсушують і далі досліджують препарат з олійною імерсією об'єктива. Суперечки забарвлюються у блакитний чи синій кольори, цитоплазма – у рожевий.

Для дослідження суперечка зручними об'єктами можуть служити Bacillus mesentericusабо Bacillus mycoidesу віці 4 діб.

Реактиви для фарбування бактерій. 1. Карболовий фуксинЦіля(Див. 3.2.1).

2. Метиленовий синій Леффлер(Див. 3. 2. .1).

3. Насичений водний розчин метиленового синього. 2 г барвника та 100 мл дистильованої води.

4. Хромова кислота, 5% розчин.

5. Соляна(або сірчана кислота, 1% розчин.

4. Культивування мікроорганізмів

4.1. Поживні середовища

4.1.1. Приготування поживних середовищ

М'ясо-пептонний бульйон (МПБ).Для приготування м'ясо-пептонних середовищ використовують м'ясний бульйон,який отримують наступним чином: 500 г дрібно порубаного свіжого м'яса заливають в емальованій каструлі 1 л водопровідної води, нагрітої до 50°З залишають настоюватися 12 год при кімнатній температурі або 1 год при 50-55 °С. М'ясо віджимають, екстракт проціджують через марлю із шаром вати, кип'ятять 30 хв для згортання колоїдних білків і фільтрують двічі (перший раз через марлю з ватою, другий – через паперовий фільтр). Фільтрат доливають водою до 1 л, розливають у колби, закривають ватяними пробками і стерилізують при 120°С 20 хв (корки колб закривають зверху ковпачками з паперу).

М'ясний бульйон може бути використаний у будь-який час для приготування середовищ. Якщо їх готують одразу, то попередня стерилізація м'ясного бульйону не потрібна.

Для приготування МПБ до 1 л м'ясного бульйону додають 5-10 г. пептону(перший продукт гідролізу білка) для підвищення калорійності середовища та 5 г кухонної солідо створення осмотичної активності. Середовище нагрівають до розчинення пептону, постійно помішуючи.

Встановлюють нейтральну або слаболужну реакцію середовища, приливаючи 20%-ний розчин Na2C03 до посиніння вологого червоного лакмусового папірця. Для перевірки рН середовища зручно використовувати індикатор бромтімолблау: 1-2 краплі його змішують у фарфоровій чашці з краплею бульйону. У нейтральному середовищі бромтімолблау – пляшково-зелений, у кислому – жовтий, у лужному – синій.

Після встановлення рН середу знову кип'ятять 5-10 хв, і білки, що згорнулися при зміні реакції середовища, відфільтровують через паперовий фільтр без освітлення бульйону або освітлення його білком. Для цього свіжий яєчний білок збивають з подвійною за об'ємом кількістю води і змішують з бульйоном охолодженим до 50°С. Суміш кип'ятять, помішуючи, на слабкому вогні 10 хв, потім фільтрують. Прозорий м'ясо-пептонний бульйон розливають у пробірки, закривають ватними пробками та стерилізують при 120 °С 20 хв.

М'ясо-пептонний агар (МПА).До 1 л МПБ додають 15-20 г агару. Середовище нагрівають до розчинення агару (температура його плавлення - 100°С, затвердіння - 40°С), встановлюють слаболужну реакцію середовища 20% розчином Na2C03 і через воронку розливають у пробірки (приблизно по 10 мл агару стовпчиком для подальшого розливу по чаші і по 5 мл для отримання скошеного агару - косяків).

При розливі агару краї пробірок повинні залишатися сухими, інакше прилипають пробки до скла. Пробірки з середовищем стерилізують в автоклаві за 120°С 20 хв.

4.2. Методи стерилізації

Стерилізація – це повне знищення клітин мікроорганізмів у живильних середовищах, посуді та ін.

Відомо кілька методів стерилізації. Найчастіше застосовують стерилізацію нагріванням.

4.2.1. Фламбування, або прожарювання

Гартувати можна безпосередньо перед вживанням платинові петлі, голки, шпателі, дрібні металеві предмети (ножиці, ланцети, пінцети), а також скляні палички, предметні, покривні стекла тощо.

4.2.2. Стерилізація сухим жаром

Її застосовують для обробки посуду та сухих матеріалів, наприклад крохмалю, крейди. При цьому стерилізований об'єкт витримують при 170 ° С протягом 2 годин (з моменту встановлення необхідної температури) в електросушильних шафах. Піднімати температуру вище 170 ° С не рекомендується: ватяні пробки та папір починають руйнуватися.

Перед стерилізацією скляний посуд закривають ватяними пробками та обгортають папером. Чашки, пробірки, піпетки, вату, марлю загортають у папір або поміщають у спеціальні футляри та пенали, в яких стерильний посуд може зберігатися після стерилізації.

Після закінчення стерилізації шафу відкривають тільки після того, як температура знизиться до кімнатної, інакше скло може луснути.

4.2.3. Стерилізація текучою парою

Плинною парою (100 °С) обробляють предмети, що псуються від сухої жару, і деякі живильні середовища, що не витримують більше високої температури(середовища з вуглеводами, МПЗ, молоко). Стерилізують у кип'ятильнику Коха по 30 хв протягом 3 діб щодня. Така стерилізація називається дробової.

При одноразовому прогріванні при температурі 100 °С протягом 30 хв гинуть вегетативні клітини, суперечки багатьох мікроорганізмів залишаються життєздатними. Після такого прогріву середовище поміщають на 24 год термостат при 28-30 °С. Суперечки, що збереглися при першому нагріванні, встигають, за цей час прорости у вегетативні форми, які гинуть при подальшому нагріванні. Потім цю операцію повторюють ще двічі.

4.2.4. Стерилізація насиченою парою під тиском

Це найбільш швидкий та надійний спосіб стерилізації, при якому гинуть найстійкіші суперечки. З його допомогою стерилізують більшість поживних середовищ, посуд.

Обробку насиченою парою проводять в товстостінному котлі, що герметично закривається. автоклав.На кришці або збоку автоклава знаходяться кран для виходу пари, манометр та запобіжний клапан. Манометр показує, наскільки тиск пари всередині котла вищий за нормальний. Для запобігання вибуху при перевищенні граничного тиску спрацьовує запобіжний клапан, даючи вихід парі.

Показнику манометра у фізичних атмосферах відповідає певна температура.

Надійної стерилізації досягають нагріванням при 120 °З тиском 1 атм протягом 20 хв.

Стерилізацію ведуть в такий спосіб. Наливають воду в автоклав, поміщають в нього предмети, що стерилізуються, загвинчують кришку автоклава і починають підігрів. Кран залишають відкритим доти, доки все повітря, що знаходиться в автоклаві, не буде витіснене парами води. Коли пара почне виходити з крана безперервним струменем, кран закривають, тиск пари в автоклаві доводять до 1 атм і підтримують на цьому рівні 20-30 хв. Потім нагрівання припиняють, чекають, поки стрілка манометра опуститься до 0, обережно (помалу) відкривають кран і спускають пару. Тільки потім відкручують кришку автоклава. Якщо кран відкрити раніше, ніж впаде тиск, то рідина в судинах, що стерилізуються, закипить і виштовхне з них пробки.

Автоклав використовують і для дробової стерилізації плинною парою. У цьому випадку кришку не загвинчують, щоб забезпечити вільний вихід пари.

4.2.5. Пастеризація

Пастеризація є неповною, або частковою, стерилізацією, що означає нагрівання при 65-80°С протягом відповідно 30-10 хв з подальшим швидким охолодженням до 10-11°С. Пастеризують молоко, пиво, вино та інші продукти.

Матеріали та обладнання

МПБ, агар, лакмус червоний, бромтимолблау, порцелянові пластинки з лунками або чашки, скляні палички, 20% розчин Na2C03, пробірки в штативах (для розливу агару), воронки, вата, чашки Петрі, піпетки Мора на 1 мл, папір для обгортання чашок та піпеток, колби ємністю 250 мл, суворі нитки.

5. Облік чисельності та виділення чистої культури мікроорганізмів

5.1. Методи обліку чисельності мікроорганізмів

5.1.1. Облік чисельності мікроорганізмів (КОЕ) у ґрунті методом поживних пластин у поєднанні з методом послідовних розведень

Грунт – найбільш сприятливе середовище для розвитку мікроорганізмів. У зв'язку з великою гетерогенністю її складу для врахування чисельності у ній мікроорганізмів з досліджуваної ділянки беруть середнюґрунтову пробу.

Спочатку готують суспензії (методом розведення), що містять різні концентрації ґрунту в 1 мл води. Для цього на стерильне годинникове скло стерильним фарфоровим шпателем або алюмінієвою чайною ложкою беруть з банки або мішка навішування грунту в 1 г. Годинникове скло, шпатель, ложку фламбують в полум'ї пальника або, змочивши в спирті, обпікають. При зважуванні ґрунту годинникове скло накривають іншим стерильним годинниковим склом.

Наважку ґрунту, дотримуючись умов асептики, переносять у колбу на 250 мл з 99 мл стерильної води. Суміш збовтують 5 хв, не змочуючи пробку. Стерильною піпеткою беруть 1 мл суспензії, що містить 10-2 г ґрунту, і переносять у пробірку з 9 мл стерильної водопровідної води. Піпетку промивають неодноразово водою в пробірці, щоб максимально змити клітини з її стінок. Інший стерильною піпеткою беруть з колби ще 1 мл суспензії і поміщають у другу колбу, що також містить 99 мл стерильної водопровідної води. Цю піпетку промивають так само, як і в першому випадку. Пробірку та другу колбу збовтують 1 хв. Концентрація ґрунту в пробірці буде 10-3 г, у другій колбі -10-4 г. Так само новими стерильними піпетками переносять по 1 мл суспензії з другої колби в другу пробірку з 9 мл і в третю колбу з 99 мл стерильної водопровідної води і готують нові суспензії, що містять в 1 мл відповідно 10-5 та 10-6 г ґрунту.

ЗАГАЛЬНА МІКРОБІОЛОГІЯ
Глава I. Мікроскоп та техніка мікроскопіропання
1. Світлооптична мікроскопія
2. Мікроскопія у темному полі
3. Фазово-контрастна мікроскопія
4. Люмінесцентна (флуоресцентна) мікроскопія
Розділ II. Загальні уявлення про культивування, техніку посіву та необхідне обладнання для роботи з мікроорганізмами
Розділ III. Методи приготування препаратів мікроорганізмів
Розділ IV. Дослідження мікробної клітини
1. Форми клітин мікроорганізмів
2. Будова клітин мікроорганізмів (цитохімічні методи дослідження)
3. Забарвлення клітин мікроорганізмів за Грамом
4. Забарвлення спор у бактерій
5. Забарвлення капсул
6. Забарвлення джгутиків
7. Забарвлення ядерної речовини бактерій
8. Забарвлення включень клітин мікроорганізмів
Глава V. Харчування мікроорганізмів
1. Значення окремих поживних елементів
2. Приготування поживних середовищ
3. Методи стерилізації
Розділ VI. Облік чисельності бактерій та виділення чистої культури
1. Облік чисельності бактерій у грунті
2. Визначення якісного складубактерій
3. Облік чисельності мікроорганізмів у воді та інших рідинах
4. Облік чисельності бактерій у повітрі
5. Виділення чистих культур бактерій
Розділ VII. Визначення виду бактерій
Розділ VIII. Перетворення мікроорганізмами безазотистих органічних речовин
Процеси бродіння
1. Спиртове бродіння
2. Молочнокисле бродіння
3. Маслянокисле бродіння
4. Бродіння пектинових речовин
5. Бродіння целюлози
6. Окислення клітковини
7. Окислення жиру
8. Окислення вуглеводнів
Розділ IX. Перетворення мікроорганізмами органічних та мінеральних сполук азоту
1. Амоніфікація
2. Нітрифікація
3. Денітрифікація (нітратне дихання)
4. Біологічна фіксація атмосферного азоту
Глава X. Перетворення мікроорганізмами сполук сірки, заліза та фосфору
1. Перетворення мікроорганізмами сполук сірки
2. Участь мікроорганізмів у перетворенні заліза
3. Перетворення мікроорганізмами сполук фосфору
СІЛЬСЬКОГОСПОДАРСЬКА МІКРОБІОЛОГІЯ
Розділ XI. Загальний мікробіологічний аналіз ґрунту
1. Методи досліджень
2. Групи мікроорганізмів, склад та приготування поживних середовищ
3. Взяття середньої ґрунтової проби та підготовка зразка до мікробіологічного аналізу
4. Приготування ґрунтової суспензії
5. Облік різних груп мікроорганізмів
6. Визначення загальної кількості мікроорганізмів у ґрунті методом прямого рахунку під мікроскопом
Розділ XII. Вивчення цінозів мікроорганізмів
1. Метод обростання скла за Н. Г. Холодним
2. Вивчення мікробних ценозів у ґрунті за методом Перфільєва та Габе
3. Метод капілярів Перфільєва у модифікації Арістівської
4. Виявлення мікроорганізмів автохтонної групи, що бере участь у розкладанні гумусових речовин, за методом Виноградського у модифікації Теппер
5. Виявлення мікроорганізмів, що беруть участь у розкладанні гумусових речовин, за методом Тепер
Розділ XIII. Визначення біологічної активності ґрунту
1. Визначення біологічної активності грунту за інтенсивністю розкладання полотна (метод Мішустіна, Вострова та Петрової)
2. Визначення загальної мікробіологічної активності ґрунту щодо виділення вуглекислого газу
3. Визначення амоніфікуючої активності ґрунту
4. Визначення амоніфікуючої активності мікроорганізмів
5. Визначення нітрифікуючої активності ґрунту
6. Визначення денітрифікуючої активності ґрунту
7. Визначення азотфіксуючої активності мікроорганізмів
Розділ XIV. Вивчення бактерій кореневої зони рослин та на коренях
1. Облік бактерій у ризосфері методом Красильникова
2. Облік ризосферної та кореневої мікрофлори методом послідовних відмивань коренів за Е. 3. Теппер
3. Виділення чистих культур бульбочкових бактерій, кількісний облік у ґрунті, визначення їх активності та вірулентності
Розділ XV. Аналіз бактеріальних препаратів
Розділ XVI. Мікробіологія кормів
1. Епіфітна мікрофлора зерна та її зміна при зберіганні корму
2. Аналіз силосу
3. Дріжджування корму
Розділ XVII. Мікрофлора молока та молочних продуктів
1. Бактеріологічний аналіз молока
2. Методи виділення молочнокислих бактерій у чисту культуру
3. Знайомство з мікрофлорою вершкового масла
Покажчик літератури

Методичні рекомендації

з виконання практичних робіт

для професії:

19.01.17 Кухар. Кондитер

Розробник:

Веретеннікова О.М. викладач

Валуйки, 2016

Пояснювальна записка

Дані методичні вказівки для виконання практичних робіт з дисципліниоснови мікробіології, санітарії та гігієни у харчовому виробництві » були розроблені на основі Федерального державного освітнього стандарту(далі – ФГОС) за фахом:

19.01.17 Кухар. Кондитер

Методичні вказівки для виконання практичних робіт призначені для студентів першого курсуВиконання практичних та лабораторних робіт спрямоване на вирішення наступнихзавдань:

підвищити усвідомлення та міцність засвоєння знань;

розвивати вміння аналізувати, порівнювати об'єкти, що вивчаються, проводити дослідження, складати таблиці, схеми, кластери, робити висновки;

розвивати в учнів логічне мислення, пізнавальні здібності, самостійність;

навчити використовувати отримані знання та вміння в житті.

При вивченні, закріпленні матеріалу використовуються такі типи самостійних робіт:

Робота із текстом підручника.

Робота із презентацією.

Робота з об'єктом, що вивчається.

Робота з таблицею.

Робота зі складання кластера, схеми.

Робота із готовими мікропрепаратами. Приготування мікропрепаратів.

Структура методичних вказівок:

1. тема
2. мета роботи
3. обладнання для виконання робіт
4. хід роботи
5. контроль та актуалізація знань студентів, необхідних для виконання роботи
6. умови виконання роботи

Кожна практична та лабораторна робота має бути оформлена у зошиті для практичних робіт відповідно до рекомендацій. (Додаток 1)

Контроль результатів виконаних робіт здійснюється на підставі письмового звіту та результатів спостереження за учням під час виконання роботи відповідно докритеріями оцінок за виконання практичної роботи.

Перелік практичних робіт

Практична робота №1

Влаштування мікроскопа та правила роботи з ним.

Практична робота №2 Вивчення під мікроскопом морфології дріжджів та плісняви

Практична робота № 3 Схеми будови клітин бактерій, дріжджів, грибів.

Практична робота № 4-5

Практична робота № 6Схеми приготування дезінфікуючих розчинів та їх зберігання

Практичні завдання, спрямовані на перевіркуумінь учнів застосовувати теоретичні знання з дисципліни на практиці

Практична робота №1 ПРИСТРІЙ МІКРОСКОПА І ПРАВИЛА РОБОТИ З НИМ.

Мета роботи: Вивчити пристрій світлового біологічного мікроскопа та освоїти правила роботи з ним.

Обладнання, матеріали: мікроскоп; готові мікропрепарати

Мікроскоп (Від грец.micros– малий таscopio– дивлюсь) – це оптичний прилад, що складається з трьох основних частин: механічної, оптичної та освітлювальної.

Схема світлового біологічного мікроскопа представлена ​​рис. 1.

Механічна частина або штатив складається з ніжки, основи, тубусоутримувача, предметного столика, монокулярної насадки (тубуса), револьверного пристрою, рукоятки грубого фокусування (макрометричного гвинта), рукоятки тонкого фокусування (мікрометричного гвинта).

Тубус – зорова труба мікроскопа. У верхній отвір тубуса вільно вставляється окуляр, на нижньому кінці тубуса знаходиться револьверний пристрій (револьвер), що обертається навколо своєї осі, в яке загвинчуються об'єктиви. Повертаючи револьвер, можна швидко змінити об'єктиви під час роботи з мікроскопом, підводячи будь-який об'єктив під тубус. Об'єктив може бути центрований, тобто. встановлений на оптичну вісь мікроскопа. Для цього револьвер повертають довкола своєї осі до появи клацання.

Предметний столик служить розміщення у ньому досліджуваного препарату. Препарат закріплюють на столику затискачами (клеммами). У центрі предметного столика знаходиться отвір для проходження променів світла та освітлення препарату. У деяких конструкціях мікроскопа предметний столик може пересуватися за допомогою гвинтів, розташованих на периферії предметного столика. Це дає можливість розглянути препарат у різних полях зору.

1 – окуляр

2 – монокулярна насадка

(Тубус)

3 - Револьверний пристрій

4 - об'єктив

5 – предметний столик

6 - конденсор

7 – корпус колекторної лінзи

8 – патрон із лампою

9 - шарнір

10 – рукоятка переміщення кронштейна конденсора

11 – рукоятка тонкого фокусування (мікрометричний гвинт)

12 – рукоятка грубого фокусування (макрометричний гвинт)

13 - тубусоутримувач

14 – гвинт для кріплення насадки

Мал. 1Схема влаштування світлового біологічного мікроскопа

Рукоятки грубого і тонкого фокусування (макро- та мікрогвинти) служать для переміщення тубуса вгору і вниз, що дозволяє встановити його на потрібній відстані від препарату. При обертанні гвинтів за годинниковою стрілкою тубус опускається, а при обертанні проти годинникової стрілки піднімається. При обертанні макрометричного гвинта об'єктив орієнтовно встановлюється фокус, тобто. на ту відстань від препарату, при якому він стає видимим. Оборот макровинта дозволяє перемістити тубус на 20 мм. Мікрометричний гвинт служить для точного встановлення на фокус. Повний оберт його переміщає тубус на 0,1 мм. З мікрогвинтом слід поводитися дуже обережно: допустимо обертання мікрогвинта не більше ніж на 180 0 З у той чи інший бік.

Оптична частина є найціннішою частиною мікроскопа. Вона складається з об'єктивів та окуляра.

Окуляр (від лат.oculus– око) складається з двох плоскопуклих лінз, укладених у загальну металеву оправу. Верхня лінза - очна (збільшує), нижня - збирає. Відстань між лінзами дорівнює напівсумі їх фокусної відстані. У окулярів з великим збільшенням фокус коротший, тому менша і довжина окуляра. Між лінзами є діафрагма, що обмежує поле зору та затримує крайові промені світла. Вітчизняні мікроскопи забезпечені трьома змінними окулярами, збільшення яких вказано на корпусі окуляра (х7; х10; х15).

Об'єктиви вкручуються в гнізда револьверного пристрою і складаються із системи лінз, укладених у металеву оправу. Передня (фронтальна) лінза об'єктива є найменшою та єдиною, що дає збільшення. Інші лінзи в об'єктиві лише виправляють недоліки отриманого зображення (яви сферичної та хроматичної аберації) і називаються корекційними.

У гнізда револьверного пристрою вкручуються чотири об'єктиви, збільшення яких вказано на корпусі об'єктива (х8; х20; х40; х90 або 100). Кожен об'єктив характеризується своєю фокусною відстанню (відстанню між предметним склом та фронтальною лінзою): об'єктив х8 має фокусну відстань близько 9 мм, об'єктив х40 – 0,65 мм, об'єктив х90 – 0,15 мм.

Освітлювальна частина Мікроскоп складається з дволінзового конденсора, ірис-діафрагми і патрона з низьковольтною лампочкою розжарювання, що живиться через понижувальний трансформатор від мережі напруги 120 ... 220 В.

Конденсор служить для кращого висвітлення препарату. Він збирає світлові промені в пучок і спрямовує їх через отвір предметного столика на препарат. За допомогою рукоятки для переміщення кронштейна конденсора його можна переміщати вгору та вниз, завдяки чому змінюється кут збіжності променів і, отже, ступінь освітлення об'єкта. Чим вище становище конденсора, тим краще освітлений препарат.

Ірис-діафрагма розташовується під конденсором і служить для регулювання потоку світла, що надходить у конденсор. Вона складається із металевих серповидних пластинок. Розширити або звузити отвір діафрагми можна за допомогою спеціального важеля. При обертанні його за годинниковою стрілкою отвір ірис-діафрагми збільшується і, отже, збільшується ступінь освітлення об'єкта.

При роботі з імерсійними об'єктивами ступінь освітлення препарату має бути максимальним, тому шторку ірис-діафрагми відкривають, а конденсор піднімають у крайнє верхнє положення.

Працюючи з сухими об'єктивами, зазвичай, розглядають незабарвлені об'єкти. Для досягнення контрастності конденсор опускають донизу, а отвір ірис-діафрагми зменшують.

Правила роботи з мікроскопом

На робочому столі мікроскоп ставлять тубусодержателем до себе з відривом 3…5 див від краю столу;

Включають мікроскоп у мережу та встановлюють правильне освітлення

На предметний столик поміщають досліджуваний препарат та закріплюють його клемами;

Під тубус поміщають потрібний об'єктив і за допомогою макро та мікрогвинтів встановлюють фокусну відстань. Так, при роботі з імерсійними об'єктивами на препарат попередньо наносять краплю імерсійної олії та обережно опускають тубусодержатель макровінтом до зіткнення зі склом. Потім, уважно дивлячись в окуляр, дуже повільно піднімають тубусоутримувач, обертаючи його проти годинникової стрілки, доки не побачать зображення. Точне наведення об'єктива на фокус роблять мікрометричним гвинтом. Працюючи з сухими об'єктивами препарат спочатку розглядають з об'єктивом х8. Піднімаючи за допомогою макрогвинта тубусоутримувач і уважно дивлячись в окуляр, встановлюють фокусну відстань (близько 9 мм) і досягають чіткості зображення, використовуючи мікрометричний гвинт. Далі, рухаючи предметний столик або предметне скло, встановлюють в центр поля ту ділянку препарату, в якому найкраще видно об'єкт, що вивчається. Потім, обертаючи револьверний пристрій навколо осі, під тубус поміщають об'єктив на х20 або х40. При цьому під тубус не має потрапити об'єктив х90. У револьверному пристрої об'єктиви розташовуються таким чином, що якщо знайдено зображення з об'єктивом х8, то при розгляді препарату з більшими об'єктивами потрібно злегка підрегулювати чіткість зображення за допомогою макро- і мікрометричних гвинтів;

Під час мікроскопування необхідно тримати обидва очі відкритими та користуватися ними поперемінно;

Після закінчення роботи слід прибрати препарат з предметного столика, опустити вниз конденсор, поставити під тубус об'єктив х8, видалити м'якою тканиною або марлею, змоченою у спирті, імерсійну олію з фронтальної лінзи об'єктива х90, під об'єктив покласти марлеву серветку, опустити тубусоутримувач.

Яким є пристрій біологічного мікроскопа?

З яких частин та механізмів складається механічна частина мікроскопа?

Що становить оптичну систему мікроскопа?

Що входить до складу освітлювальної системи мікроскопа?

Як налаштувати освітлювальну систему під час роботи з імерсійним об'єктивом?

Перелічити основні правила роботи із мікроскопом.

Умови виконання завдання
1. Місце (час) виконання завдання
Кабінет біології

Практична робота №2 Вивчення під мікроскопом морфології дріжджів та плісняви.

Мета роботи : Ознайомитись з морфологічними особливостями грибів та дріжджів, що зустрічаються при виробництві харчових продуктів. Освоїти техніку мікроскопічного дослідження грибів та дріжджів у препаратах «роздавлена ​​крапля».

Обладнання, матеріали: мікроскоп; препарувальні голки, предметні та покривні скла; фільтрувальний папір; спиртування; культури грибів пологівMucor, Aspergillus, Penicillium, Alternaria; чиста культура дріжджівSaccharomycescerevisiae.

1. КОРОТКІ ТЕОРЕТИЧНІ ПОЛОЖЕННЯ

1. 1. Морфологія та культуральні ознаки мікроскопічних грибів

Вегетативне тіло грибів називаєтьсяміцелієм . Міцелій складається з безлічі ниток-трубочок, що переплітаються.гіфами . Діаметр гіфів коливається від 5 до 50 мкм. Залежно від будови міцелію гриби поділяються на вищі та нижчі. У вищих грибів гіфи розділені перегородками (септами) у яких є велика пора. Вони ростуть і при цьому відбуваються поділу ядер, але не відбувається клітинних поділів. Таким чином, вегетативне тіло гриба є однією великою багатоядерною клітиною. Всі мікроскопічні гриби можуть вегетативно розмножуватися шматочком міцелію.

При безстатевому розмноженніу фікоміцетів утворюютьсяспорангієносці , а в аскоміцетів -конідіоносці .

Культуральні ознаки мікроскопічних грибів

Колонії мікроскопічних грибів за розмірами у багато разів перевершують колонії одноклітинних організмів (бактерій, грибів) і нерідко розростаються по всій поверхні живильного середовища у чашках Петрі. Консистенція грибних колоній різна. Найчастіше утворюються повстяні та шкірясті колонії, рідше крихіті. Поверхня колоній може бути пухнастою, як вата, бархатистою, борошнистою, павутиноподібною, ниткоподібною, шкірястою або гладкою. При зростанні на щільних та рідких середовищах частина гіфів вростає в живильне середовище, утворюючисубстратний міцелій, а інша частина гіфів утворюєповітряний міцелій у вигляді пухнастого нальоту, видимого неозброєним оком. Міцелій може бути безбарвним (білим, сіруватим) або пофарбованим (чорним, бурим, зеленим, жовтим і т.д.). Пігментований тільки плодоносний міцелій.

Характеристика мікроскопічних грибів різних класів

Морфологічні особливості грибів різних класів представлені на рис. 5.

РідMucor . Вони можуть розмножуватися безстатевим та статевим шляхом з утворенням спорангієносців (рис. 5). Зовні спорангій покритий тонкими шипами із кристалів щавлевокислого кальцію. При дозріванні спорангій розривається, спорангієспори вивільняються і розносяться повітряними потоками. На спорангієносці після звільнення спорангія від суперечок залишається колонка, а в нижній її частині – комір. Колір міцелію мукорових грибів спочатку білий, потім сірувато-оливковий, вид - повстяний.

а

б

в

г

Мал. 5Морфологічні особливості грибів різних класів:

а - Mucor; б - Penicillium; в - Aspergillus; г - Alternaria

Мукорові гриби ростуть на поверхні вологого зерна, солоду, коренеплодів, на харчових продуктах, на стінах сирих приміщень у вигляді сірого пухнастого нальоту.Mucornigricansє збудником кагатної гнилі цукрових буряків. Багато мукорових грибів використовуються в промисловості для виробництва різних органічних кислот і спирту (гриби видівMucorjavanicus, Mucorracemosus), ферментних препаратів, каротиноїдів, стероїдів.

Представники пологівAspergillus і Penicillium відносяться до класу аскоміцетів, який поєднує вищі мікроскопічні скоєні гриби. При безстатевому розмноженні за допомогою спор ці гриби утворюють конідієносці (рис. 5). Аспергіли та пеніцили відносяться до плодосумчастих грибів. Це означає, що при статевому розмноженні вони спеціальних плодових тілах утворюються аски (сумки), у яких перебувають 8 аскоспор.

До родуPenicillium відноситься близько половини всіх цвілевих грибів. Вони широко поширені в грунті, в повітрі погано провітрюваних приміщень і викликають псування різних продуктів та матеріалів. Цей гриб має септований міцелій, що гілкується (діаметр гіфів – 2…3 мкм) і септовані конідіоносці (нагадують пензлики), які на кінці розгалужуються у вигляді відростків – стеригм. Від них відходять конідії, що складаються з ланцюжків суперечка. Залежно від виду конідії можуть бути різного кольору (білі, зелені та ін.). Багато пеніцилів використовуються в промисловості для отримання різних цінних продуктів. Серед виділених штамів цього роду 25% мають антибіотичну активність, а такі види якPenicilliumnotatum, Penicilliumchrysogenumвикористовуються як продуценти пеніциліну. Деякі види пеніцилів використовуються як продуценти ферментів та ліпідів. У виробництві м'яких сирів рокфор та камамбер використовуються благородні плісняви.PenicilliumroquefortiіPenicilliumcamamberti.

Гриби родуAspergillus налічують понад 200 видів. Ці гриби мають добре розвинений міцелій, що гілкується, з численними септами. Конідієносці несептовані, верхні кінці грудоподібно або кулясто розширені у вигляді невеликої головки. На головці розташовуються кеглеподібні стеригми з ланцюжками конідій, які нагадують струмки води, що виливаються з лійки. Звідси виникла назва «лійкова пліснява» (aspergereлатиною – поливати, обприскувати). Конідії аспергіл при дозріванні набувають різного забарвлення, що поряд з іншими ознаками визначає їх видову приналежність.

Так само як і пеніцили, представники родуAspergillusшироко поширені в природі та відіграють важливу роль у мінералізації органічних речовин. Вони викликають пліснявіння багатьох харчових продуктів. Ці гриби є продуцентами багатьох цінних речовин і широко використовуються у промисловості. Так,Aspergillusnigerзастосовують у промисловості для виробництва лимонної кислоти;Aspergillusterreus- ітаконової кислотиAspergillusflavusіAspergillusterricolaутворюють найактивніший комплекс протеолітичних ферментів;AspergillusoryzaeіAspergillusawamoriє найкращими продуцентами амілолітичних ферментів.

Гриби родуAlternaria ставляться до класу недосконалих грибів – дейтероміцетів. Це найвищі гриби. Вони мають септований міцелій та короткі несептовані конідіоносці, на яких знаходяться багатоклітинні конідії грушеподібної або лимоновидної форми (рис. 5). Гриб є збудником чорної гнилі – хвороби коренеплодів та плодів, а також збудником псування харчових продуктів.

Морфологія дріжджів та їх характеристика

Дріжджі – це найвищі одноклітинні гриби. Більшість дріжджів відноситься до двох класів грибів – аскоміцетів та дейтероміцетів.

Дріжджі по відношенню до кисню діляться на факультативні анаероби (в аеробних умовах здійснюють дихання та активно накопичують біомасу, а в анаеробних умовах викликають спиртове бродіння) та аероби.

Морфологічно дріжджі різноманітні. Вони відрізняються один від одного розмірами та формою клітин. Розміри клітин дріжджів залежно від виду варіюють у межах; від 2,5 до 10 мкм у поперечнику та від 4 до 20 мкм у довжину. Морфологічне розмаїття форм дріжджів зображено на рис. 6.

а

б

в

г

д

е

ж

з

Мал. 6Форми дріжджових клітин: а – овальна яйцеподібна;

б – циліндрична; в – апікулятна; лимоноподібна; г – стрілоподібна;

д – трикутна; е – серпоподібна; ж – колбоподібна; з, і - міцелеподібна

Форма та розміри дріжджових клітин залежать від виду, віку, живильного середовища, способу культивування.

Залежно від виду дріжджі вегетативно можуть розмножуватися брунькуванням (так розмножуються дріжджі овальної форми), бінарним розподілом (характерно для дріжджів циліндричної або паличкоподібної форми) або поділом, що брунькуються. Крім вегетативного розмноження, дріжджі – аскоміцети можуть розмножуватись статевим шляхом з утворенням аскоспор.

З дріжджів, що належать до класу аскоміцетів, велике значення мають дріжджі-сахароміцети родуSaccharomyces , які широко використовуються у харчовій промисловості. Головною біохімічною ознакою цих дріжджів є те, що вони зброджують цукри з утворенням етилового спирту та діоксиду вуглецю. Дріжджі, що використовуються в промисловості, називаютьсякультурні дріжджі. Так, у хлібопекарському виробництві та у виробництві спирту використовуються верхові дріжджі родуSaccharomycescerevisiae. Дріжджі видуSaccharomycesminorзнайшли застосування у виробництві житнього хлібата квасу. У пивоварстві використовуються низові дріжджі.Saccharomycescarlsbergensis. Дріжджі-сахароміцети мають овальну форму, вегетативно розмножуються брунькуванням, у несприятливих умовах розмножуються статевим шляхом аскоспорами.

Деякі спорогенні дріжджі єдикими дріжджами . Ці дріжджі так само, як і культурні, здатні здійснювати спиртове бродіння, але, крім спирту, утворюють багато побічних продуктів (таких як альдегіди, вищі спирти, ефіри та ін) і тому погіршують органолептичні показники продукту. Ці дріжджі є шкідниками виробництва різних напоїв (пива, вина, безалкогольних напоїв), а також збудниками псування багатьох харчових продуктів.

Дріжджі - дейтероміцети можуть розмножуватися тільки вегетативним способом. Деякі з цих дріжджів (наприклад, дріжджі родуCandida) використовуються в промисловості для одержання кормового білка, органічних кислот, вітамінів та інших продуктів мікробного синтезу. Дріжджі видуTorulopsiskefirвходять до складу симбіотичної закваски – кефірного грибка. Інші представники недосконалих (аспорогенних) дріжджів є дикими дріжджами і викликають псування багатьох харчових продуктів. До дріжджів-шкідників виробництва відносяться дріжджі пологів.Pichia, Hansenula, Candida, Rhodotorula,Torula, Torulopsis, Mycoderma, Trichosporonта ін Серед аспорогенних дріжджів зустрічаютьсяпомилкові дріжджі які утворюють псевдоміцелій і ростуть на рідких субстратах у вигляді плівок.

1. ПОРЯДОК ВИКОНАННЯ РОБОТИ

На предметне скло трубочкою чи піпеткою наносять велику краплю води;

Відбирають невелику кількість міцелію з пробірки або чашки Петрі, дотримуючись правил асептики.

Міцелій акуратно поміщають у краплю, нанесену на предметне скло та за допомогою двох голок розправляють його у воді;

Препарат накривають покривним склом та злегка притискають. Надлишки води видаляють за допомогою фільтрувального паперу.

Мікроскопують препарат «роздавлена ​​крапля» спочатку з об'єктивом х8, а потім х40 у затемненому полі зору (конденсор опущений, шторка ірис-діафрагми прикрита).

При відборі та мікроскопії препаратів грибів враховують такі рекомендації:

а) гриб роду Mucor . Відбирають чорнувато-сірий пухнастий повітряний міцелій. При мікроскопії звертають увагу на гіфи із заповненими спорами спорангіями та колонки, що утворюються при звільненні спорангія;

б) гриб роду Aspergillus . Відбирають трохи пухнастого міцелію з пофарбованими конідіями, злегка заглиблюючись голкою в живильне середовище. Звертають увагу на несептовані конідієносці;

в) гриб роду Penicillium . При відборі намагаються взяти молодий міцелій (на межі пофарбованого та білого міцелію), заглиблюючись голкою у середу. Звертають увагу на септовані гіфи з пензликами.

г) гриб роду Alternaria . Беруть грибницю у чорних ділянках, заглиблюючись у неї голками. Звертають увагу на септований міцелій, слабо розвинені конідієносці і великі конідії, що мають вигляд округлих або загострених багатоклітинних утворень, що нагадують гранати-лимонки.

При дослідженні дріжджів на предметне скло наносять суспензію дріжджів, накривають покривним склом, надлишки води видаляють фільтрувальним папером. Мікроскопують препарат та об'єктивом х8 та х40.

Оформлення та аналіз результатів досліджень

Коротко конспектують теоретичний матеріал. Замальовують мікроскопічні картини досліджених культур грибів та дріжджів з урахуванням морфологічних особливостей кожного мікроорганізму. Під кожним малюнком підписують латинську назву та збільшення препарату. Описують культуральні властивості грибів, що вивчаються.

Відповісти на контрольні питання

Як готуються препарати мікроскопічних грибів та дріжджів?

Охарактеризуйте морфологічні та культуральні властивості мікроскопічних грибів.

Які гриби використовуються в промисловості для одержання органічних кислот, ферментів, антибіотиків та інших цінних продуктів?

Охарактеризуйте морфологічні властивості дріжджів.

Що таке культурні дріжджі? У яких галузях харчової промисловості вони використовують?

Умови виконання завдання

Кабінет біології

2. Максимальний час виконання завдання: 90 хв

Практична робота №3: ​​Схеми будови клітин бактерій, дріжджів, грибів.

Мета роботи: Вивчити будову клітинибактерій, дріжджів, грибів

Матеріальне забезпечення: інструктивні карти для виконання практичної роботи, підручник, олівці

Завдання 1

Вивчить матеріал підручника. За результатами вивчення:

Замалюйте у зошит будову клітини бактерій, дріжджів та грибів та вкажіть відмінні ознаки

Письменно відповісти на запитання:

1. Яку форму мають клітини бактерій?

2. Які розміри бактерій?

3. Як відбувається розмноження бактерій, швидкість розмноження?

4. Яким чином, і в яких умовах відбувається утворення спор у бактерій?

5. Чи здатні бактерії до самостійного руху?

Зробіть висновок щодо результатів роботи.

Умови виконання завдання

1. Місце (час) виконання завдання

Кабінет біології

2. Максимальний час виконання завдання: 90 хв

Практична робота на тему №4 Робота з нормативно-технічною документацією: СанПіН 2.3.6. 1079-01

Мета роботи: Вивчити санітарні вимоги до влаштування та утримання підприємств громадського харчування

Матеріальне забезпечення: інструктивні карти для виконання практичної роботи, СанПіН 2.3.6. 1079-01

Завдання 1

Вивчить матеріал підручника. СанПіН 2.3.6. 1079-01. За результатами вивчення:

1. Допишіть фрази: Ділянка, де збудовано підприємство громадського харчування, має бути

До виробничих приміщень належать:

Складські приміщення проектуються у ____________________ частини будівлі.

Питна вода за якістю має відповідати

Для очищення повітря використовується вентиляція

Типу.

Усі виробничі приміщення повинні висвітлюватись

Світлом.

Щомісячне прибирання приміщень називається

2. Дайте визначення наступним поняттям:

Дезінфекція це –

Дератизація це –

Дезінсекція це –

3. Використовуючи навчальний матеріал, заповніть таблицю:

Овочевий цех

М'ясний цех

Рибний цех

Гарячий цех

холодний цех

Кондитерський цех

Роздавальна

Умови виконання завдання

1. Місце (час) виконання завдання

Кабінет біології

2. Максимальний час виконання завдання: 90 хв

Практична робота № 5 Робота з нормативно-технічною документацією: СанПіН 2.3.6. 1079-01

Мета роботи : Вивчити санітарні вимоги до обладнання, інвентарю, посуду, тари. Транспортування та зберігання харчових продуктів.

Матеріальне забезпечення : інструктивні карти для виконання практичної роботи, СанПіН 2.3.6. 1079-01

Завдання 1

Вивчить матеріал підручника, СанПіН 2.3.6. 1079-01. За результатами вивчення:

1. Письменно дайте відповідь на запитання:

Що стосується кухонному посуді?

Навіщо маркують посуд?

Що стосується столового посуду?

Які матеріали допускаються для виробництва обладнання та інвентарю

для підприємств комунального харчування?

У чому полягає принципова різниця при миття столового посуду та столових приладів?

2. Перерахуйте правила та вимоги:

2.1. Санітарні правила перевезення напівфабрикатів:

2.2. Санітарні правила зберігання харчових продуктів:

3. Допишіть фрази:

До початку роздачі якість готових страв має

При подачі перші страви та гарячі напої повинні мати температуру

_______ °С, другі страви та гарніри температуру ______ °С, порційні страви

температуру ______ °С, холодні страви та напої ______ °С.

У лікувально-профілактичних та дитячих закладах у зимово-весняний період через нестачу в овочевих стравах ___________________ потрібно збагачувати цим деякі страви.

За якість готової продукції та дотримання правил її відпустки на підприємствах громадського харчування відповідають ________________

Умови виконання завдання

1. Місце (час) виконання завдання

Кабінет біології

2. Максимальний час виконання завдання: 90 хв

Практична робота № 6 Схеми приготування дезінфікуючих розчинів та їх зберігання

Ціль: вивчити найменування дезінфікуючих засобів, способи приготування розчинів, що дезінфікують, залежно від призначення. Приготувати розчин заданої концентрації.

Матеріальне забезпечення : інструктивні карти для виконання практичної роботи, СанПіН 2.3.6. 1079-01, підручник

Завдання 1

Вивчить матеріал навчальної літератури, СанПіН 2.3.6. 1079-01. За результатами вивчення:

1. Відповісти на запитання:

Які розчини належать до дезінфікуючих?

З якою метою застосовують дезінфікуючі розчини?

Які препарати використовують як дезінфектори?

Як розпізнати, що посуд обробляли дезінфекторами?

2. Вивчити схеми приготування та призначення дезінфікуючих засобів. Заповнити таблицю.

3. Приготувати 1л 0,2% розчину хлораміну Б.

4. Зробити висновок за результатами роботи.

Умови виконання завдання

1. Місце (час) виконання завдання

Кабінет біології

2. Максимальний час виконання завдання: 90 хв

Критерії оцінок за виконання практичної роботи:
Оцінка «5» ставиться, якщо :
1. Правильною самостійно визначає мету даних робіт; виконує роботу у повному обсязі з дотриманням необхідної послідовності проведення.
2. Самостійно, раціонально обирає та готує для виконання робіт необхідне обладнання; проводить дані роботи в умовах, що забезпечують отримання найточніших результатів.
3. Грамотно, логічно описує перебіг робіт, правильно формулює висновки; точно та акуратно виконує всі записи, таблиці, малюнки, креслення, графіки, обчислення.
4. Виявляє організаційно-трудові вміння: - підтримує чистоту робочого місця, порядок на столі, економно витрачає матеріали; дотримується правил техніки безпеки під час виконання робіт.
Оцінка «4» ставиться, якщо :
1. Виконує лабораторну роботу повністю відповідно до вимог при оцінюванні результатів на "5", але допускає у обчисленнях, вимірах два - три недоліки або одну негрубу помилку та один недолік.
2. При оформленні робіт допускає неточності у описі ходу дій; робить неповні висновки під час узагальнення.
Оцінка «3» ставиться, якщо :
1.1 Правильно виконує роботу щонайменше, ніж 50%, проте обсяг виконаної частини такий, що дозволяє отримати правильні результати і зробити висновки з основним, принциповим важливим завданням роботи.
2. Підбирає обладнання, матеріал, починає роботу з допомогою викладача; або в ході проведення вимірювань, обчислень, спостережень припускається помилок, неточно формулює висновки, узагальнення.
3. Проводить роботу в нераціональних умовах, що призводить до отримання результатів із великими похибками; або у звіті допускає загалом трохи більше двох помилок (у записах чисел, результатів вимірів, обчислень, складанні графіків, таблиць, схем тощо.), які мають даної роботи принципового значення, але які вплинули результат виконання.
4. Допускає грубу помилку в ході виконання роботи: у поясненні, в оформленні, дотриманні правил техніки безпеки, яку учень виправляє на вимогу вчителя.
Оцінка "2" ставиться, якщо :
1. Не визначає самостійно мету роботи, не може без допомоги викладача підготувати відповідне обладнання; виконує роботу в повному обсязі, і обсяг виконаної частини не дозволяє зробити правильні висновки.
2. Допускає дві і грубіші помилки під час робіт, які може виправити на вимогу педагога; або здійснює вимірювання, обчислення, спостереження невірно.

ДОДАТОК.

Додаток 1

ПАМ'ЯТКА СТУДЕНТУ

За виконання роботи студент зобов'язаний:

Попередньо докладно ознайомитися з теоретичним матеріалом і добре зрозуміти мікробіологічні закономірності та процеси, які слід вивчити практично.

Виконуючи експеримент, дотримуватися всіх запобіжних заходів, послідовність операцій, проводячи необхідні спостереження.

Записати результати досвіду у зошиті за схемою, запропонованою у роботі:

Після закінчення роботи упорядкувати робоче місце і здати його лаборанту або викладачеві.

ПІДРУЧНИКИ ТА НАВЧАЛЬНІ ПОСІБНИКИ ДЛЯ СТУДЕНТІВ

ВИЩИХ НАВЧАЛЬНИХ ЗАКЛАДІВ

В. Н. КИСЛЕНКО

ПРАКТИКУМ

ПО ВЕТЕРИНАРНІЙ

МІКРОБІОЛОГІЇ

І ІМУНОЛОГІЇ

Допущено Міністерством сільського господарства РФ у

якості навчального посібникадля студентів вищих

навчальних закладів, які навчаються за фахом

«Ветеринарія»

МОСКВА «Колос» 2005

УДК 619: 579(075.8) ББК 48я73 К44

Редактор Т.С. Мояочаєва
Рецензенти: доктор ветеринарних наук, професор В. І. Плешакова(Інститут вієте

ринарної медицини Омського ДАУ); доктор ветеринарних наук, професор IT. І. Ба

ришників(Інститут ветеринарної медицини Алтайського ДАУ)

Кисленко В. М.

К44 Практикум з ветеринарної мікробіології та імунології. - М.: Колос, 2005. - 232 с. арк.: іл. - (Підручники та навч. посібники для студентів вищ. навч. закладів). ISBN 5-9532-0332-2

Практикум складається із двох розділів. Розділ «Загальна мікробіологія» містить відомості про правила роботи у бактеріологічній лабораторії, опис основних мікробіологічних, генетичних та імунологічних методів вивчення мікроорганізмів. У розділі «Збудники інфекційних хвороб» перераховано методи лабораторної діагностики, диференціації збудників та надано перелік застосовуваних біопрепаратів.

Наведено методичні вказівки щодо проведення практичних занять для викладачів.

Додаються комплекти тестів на електронному носії (CD-диску) за загальною та приватною мікробіологією, імунологією, а також за теоретичним курсом.

Для студентів вищих навчальних закладів за спеціальністю "Ветеринарія".

ВСТУП

Ветеринарні лабораторії – це установи державної ветеринарної служби, діяльність яких спрямована на забезпечення благополуччя у тваринництві, попередження та ліквідацію хвороб та загибелі тварин, а також на охорону населення від хвороб, загальних для тварин та людини. За призначенням ветеринарні лабораторії бувають районні, міжрайонні (зональні), обласні (крайові) та республіканські.

Основне завдання ветеринарних лабораторій – встановлення точного діагнозу хвороб сільськогосподарських тварин, включаючи птахів, хутрових звірів, риб та бджіл, а також проведення експертизи м'яса, молока та інших харчових продуктів тваринного та рослинного походження. У лабораторіях також виконують наукові роботи, здійснюють виробництво деяких біостимуляторів, антибіотиків та ін.

Матеріалом для лабораторних досліджень є кров, сеча, мокротиння, молоко, фекалії, вміст абсцесів (гній), отримані за життя тварини; шматочки паренхіматозних органів або інших тканин після їх загибелі, проби об'єктів довкілля (вода, повітря, грунт, корми, рослини, змив з предметів догляду). Матеріал у лабораторії досліджують бактеріологічними, серологічними, гістологічними, біохімічними, мікологічними та токсикологічними методами, для чого мають бути створені необхідні умови (спеціально відведені приміщення, обладнання, мікроклімат та ін.).

Лабораторія займає окрему будівлю, розташовану далеко від проїжджих доріг. У ній мають бути приймальне відділення, пато-логоанатомічний, бактеріологічний, серологічний, біохімічний та вірусологічний відділи, а також спеціальні приміщення для термостатів, миття посуду, автоклавний. У кімнаті для миття посуду знаходяться столи, раковини, гаряче та холодне водопостачання, газова або електрична плита, стелажі для вимитого посуду, витяжна шафа, емальовані ванни, тази та інші ємності, розчин кислоти у скляних посудинах для знезараження піпеток, предметних шибок та предметного скла. . Окреме приміщення відводять під бактеріологічну кухню (середово-рочна), де готують живильні середовища для культивування мікроорганізмів, готують посуд для стерилізації. Тут же у шафах зберігають стерильний посуд та добре упаковані хімічні речовини, компоненти живильних середовищ.

Для виконання роботи в асептичних умовах обладнають спеціальні ізольовані приміщення. бокси(англ. box - коробка), що складаються з власне боксу та передбоксника. Використовують також настільні бокси, предмети та повітря у яких знезаражують лампами УФІ, та ламінарні шафи, де крім цього застосовують активне видалення повітря.

Лабораторних тварин (білих мишей, морських свинок, білих щурів, кроликів та ін.) розміщують у віварії.Як правило, у віварії містять також здорових баранів-донорів, кров яких використовують для реакції зв'язування комплементу (РСК) та приготування живильних середовищ. Заражених лабораторних тварин утримують в ізольованому приміщенні.

Крім того, у будівлі є кімнати для фахівців, обслуговуючого персоналу, кабінет завідувача, бібліотека, вагова, роздягальня, склад та ін.

Щоб підтримувати належну чистоту, підлогу в кімнатах покривають лінолеумом або кахельною плиткою. Стіни та стелі, як правило, гладкі (без карнизів та ліпних прикрас), із закругленими кутами, пофарбовані у світлі тони масляною фарбою. Стелі можна білити вапном. Бажано облицьовувати стіни пластиком або плиткою від підлоги до стелі.

У лабораторії повинні бути гаряча та холодна вода, каналізація, педальні відра для сміття, які щодня звільняють, миють та дезінфікують, рушники, мило та дезінфікуючий розчин. У кімнатах знаходиться тільки необхідне обладнання: столи, шафа для зберігання дрібної апаратури, фарб, реактивів, посуду, інструментів і т. п. Столи зазвичай встановлюють перед вікнами. Вони мають бути стійкими, зручними, висотою 80 см, із закраїнкою. Поверхню столів покривають пластиком чи лінолеумом, склом чи білою спеціальною фарбою. На столі розміщують мікроскоп, також необхідні предмети для бактеріологічної роботи.

Бактеріологічний метод дослідження, як правило, включає мікроскопію, виділення та вивчення властивостей чистої культури збудника хвороби та зараження лабораторних тварин (біологічну пробу). Результати бактеріологічного аналізу за підписом завідувача відділення або директора лабораторії повідомляють лише офіційним особам: ветеринарному лікарю, зооінженеру, керівнику підприємства.

Устаткування мікробіологічної лабораторії.

Для роботи у лабораторії необхідні наступні приладита апарати: біологічні імерсійні мікроскопи з додатковими пристосуваннями (освітлювач, фазово-контрастний пристрій, темнопольний конденсор та ін.), люмінесцентні мікроскопи, термостати, апаратура для стерилізації, рН-метри, апарати для

отримання дистильованої води (дистилятор), центрифуги, технічні та аналітичні ваги, апаратура для фільтрування (фільтр Зейтца та ін.), водяні лазні, холодильники, апарат для виготовлення ватно-марлевих пробок, набір інструментів (бактеріологічні петлі, шпателі, голки, пінцети та ін), лабораторний посуд (пробірки, колби, чашки Петрі, матраци, флакони, ампули, пастерівські та градуйовані піпетки) та ін.

У лабораторії виділено спеціальне місце для фарбування мікроскопічних препаратів, де знаходяться розчини спеціальних барвників, спирт, кислоти, фільтрувальний папір та інше. Для повсякденної роботи лабораторія повинна мати у своєму розпорядженні необхідні поживні середовища, хімічні реактиви, діагностичні препарати та інші лабораторні матеріали. У великих лабораторіях є термостатні кімнати для вирощування мікроорганізмів, постановки серологічних реакцій.

Для вирощування, зберігання культур, стерилізації лабораторного посуду та інших цілей призначена така апаратура:

1. 
   Термостат. Апарат, у якому підтримується незмінна температура. Оптимальна температура для розмноження багатьох мікроорганізмів становить 37”С. Термостати бувають повітряними та водяними.
2. 
   Мікроанаеростат. Апарат для вирощування мікроорганізмів у анаеробних умовах.
3. 
   Холодильники Використовують у мікробіологічних лабораторіях для зберігання культур мікроорганізмів, поживних середовищ, крові, сироваток, вакцин та інших біологічних препаратів при температурі близько 4 °С. Для зберігання препаратів нижче 0°С призначені низькотемпературні холодильники, у яких підтримується температура -20°С та нижче.
4. 
   Центрифуги. Застосовують для осадження мікроорганізмів, еритроцитів та інших клітин, поділу неоднорідних рідин (емульсії, суспензії). У лабораторіях використовують центрифуги із різними режимами роботи.
5. 
   Сушильно-стерилізаційна шафа (піч Пастера). Призначений для повітряної стерилізації лабораторного посуду та інших матеріалів.
6. 
   Стерилізатор паровий (автоклав). Призначений для стерилізації парою під тиском. У мікробіологічних лабораторіях використовують автоклави різних моделей (вертикальні, горизонтальні, стаціонарні, переносні).

Правила роботи у мікробіологічній лабораторії.

Мікробіолог має справу з чистими культурами мікроорганізмів, які є потомством однієї клітини. Оскільки в повітрі та на поверхні предметів у лабораторії (на столах, приладах, інструментах, а також на одязі, руках та ін.) завжди присутня безліч різноманітних мікроорганізмів, слід постійно дбати про збереження чистоти культур, що вивчаються. Тому при роботі в мікробіологічній лабораторії необхідно суворо дотримуватись певних правил, одне з яких - підтримання чистоти, включаючи щоденне гігієнічне прибирання всіх приміщень.

Для знищення мікроорганізмів у повітрі та на поверхнях існують різні способидезинфекції.

Повітря у лабораторії частково очищають провітрюванням. Вентиляція різко знижує чисельність мікроорганізмів у повітрі, особливо при значній різниці температур зовні та всередині приміщення. Тривалість провітрювання щонайменше 30...60 хв.

Більш ефективний і найбільш часто застосовуваний спосіб знезараження повітря - вплив ультрафіолетовим випромінюванням (УФІ), що має високу антимікробну дію і викликає загибель не тільки вегетативних клітин, але і спір мікроорганізмів. Через слабку проникаючу здатність ультрафіолетове випромінювання не проходить через звичайне скло і легко поглинається частинками пилу. Тому для стерилізації час опромінення становить від 30 хв до кількох годин, залежно від ступеня забрудненості повітря.

Як джерело УФІ використовують бактерицидні лампи (УФО). Випромінювачем в них є електрична дуга, що виникає в парах ртуті. низького тискуі що випускає лінійний спектр ультрафіолетової області, понад 80 % енергії якого припадає на довжину хвилі 2,5 нм.

Бактерицидна лампа є скляною трубкою, вмонтованою між двома електричними контактами і включається в мережу через дросель. Трубка виготовлена ​​із спеціального скла, що пропускає всі промені з довжиною хвилі 2,5 нм і затримує випромінювання із довжиною хвилі коротше 2 нм. Слід пам'ятати, що УФІ викликає гостре запалення рогівки очей з характерною сльозотечею та світлобоязнью невдовзі після опромінення. Тому для того, щоб прямі або відбиті ультрафіолетові промені не впливали на очі, застосовують захисні окуляри. У невеликих приміщеннях при включеній бактерицидній лампі не можна перебувати.

Підлога, стіни та меблі в мікробіологічній лабораторії протирають розчинами різних речовин, що дезінфікують. Обробка пилососом видаляє з предметів пил та значну частину мікрофлори. Як дезінфікуючі розчини найчастіше використовують 0,5...3%-й водний розчин хлораміну. Особливо ретельно слід дезінфікувати поверхню столу, де проводиться робота з мікроорганізмами. Її необхідно протирати дезінфікуючим розчином перед початком роботи, так і після закінчення. На робочому столі неприпустимі зайві предмети. Всі реактиви та розчини повинні бути забезпечені етикетками та стояти на строго визначених місцях. У лабораторії не можна їсти, пити, палити. Працювати слід у халатах.

У лабораторних умовах мікроорганізми вирощують на щільних і рідких живильних середовищах, які розливають у пробірки, колби або чашки Петрі. Посуд та живильні середовища попередньо стерилізують. Внесення клітин мікроорганізмів у стерильне середовище називають посівом, або інокуляцією. Посів (або пересівання) мікроорганізмів вимагає чіткого дотримання певних правил, щоб убезпечити досліджувану культуру від забруднення сторонніми мікроорганізмами.

Посіви мікроорганізмів у стерильні середовища найкраще здійснювати в спеціальних приміщеннях – боксах. Бокс є невеликою ізольованою кімнатою, розділеною перегородкою на дві частини. В основне робоче приміщення боксу входять через тамбур, що має розсувні двері, що унеможливлює різке переміщення повітря і, отже, занесення ззовні сторонньої мікрофлори. Обладнання боксу включає стіл з поверхнею, що легко-миється, стілець, газову або спиртову пальники, бактерицидну лампу, укріплену в спеціальному штативі або змонтовану на стелі боксу. У боксі зручно мати підсобний стіл, де розмішають необхідні під час роботи предмети. Все обладнання боксу, його стіни, підлога і стеля періодично миють і протирають розчинами, що дезінфікують. Перед роботою бокс опромінюють бактерицидною лампою протягом 40...60 хв.

Після посіву пробірки або інші судини, в яких вирощують мікроорганізми, поміщають термостати, де за допомогою терморегуляторів підтримується постійна температура. Посуд із культурами мікроорганізмів, що підлягають утилізації, піддають автоклавуванню, щоб убити клітини, і тільки після цього миють. У посуд із щільними середовищами заливають розчин, що дезінфікує, який через добу видаляють, а посуд миють. Неакуратне поводження з культурами мікроорганізмів призводить до виникнення бактеріального аерозолю, що становить небезпеку здоров'ю співробітників.

Усі співробітники лабораторій, а також кафедр мікробіології, аспіранти, студенти, які приходять на заняття та працюють у науково-студентських гуртках, перш ніж приступити до роботи з заразним матеріалом (культури патогенних мікробів, трупи експериментально заражених тварин, виділення хворих тварин, кров та ін.) ) зобов'язані ознайомитися та суворо дотримуватись наступних правил роботи та техніки безпеки у ветеринарних бактеріологічних лабораторіях:

у приміщення лабораторії входять лише у спеціальному одязі: у халаті, білій шапочці чи косинці. Халат має бути наглухо застебнутий, волосся прибране під шапочку;

до лабораторії не можна проносити сторонні віші, продукти харчування. Портфелі та сумки складають у спеціально виділеному місці;

у приміщенні лабораторії категорично забороняється вживати їжу, пити та палити;

кожному працівнику (студенту) під певним номером виділяють робоче місце, мікроскоп та інше приладдя;

на робочому місці повинно бути обладнання тільки для виконання конкретного завдання. Зазвичай це набір фарб, колба з дистильованою водою, зливна чашка, банки з чистим та відпрацьованим склом, бактеріологічна петля, штатив, банка з дезінфікуючим розчином;

перед початком роботи необхідно перевірити наявність та справність приладів, посуду, газових пальників (спиртувань) та ін. Про помічені недоліки та несправності слід повідомити відповідальному, а на навчальних заняттях- викладачеві;

щоб уникнути вибуху не можна запалювати один спирт (або газовий пальник) від іншого; користуються лише сірниками;

не можна торкатися проводів та контактних частин електромережі металевими та іншими предметами;

студенти без відома викладача чи обслуговуючого персоналу не повинні включати електроприлади та апаратуру;

студенти приступають до виконання завдання лише з дозволу викладача; хід роботи повинен суворо відповідати методиці, що вивчається;

кожен: співробітник та студент повинен дотримуватися охайності в роботі, утримувати в чистоті робоче місце та обладнання;

матеріал, що використовується на навчальних заняттях, вважають особливо небезпечним;

при розпаковуванні матеріалу, надісланого для дослідження, необхідно бути обережними: банки зовні обтирають дезінфікуючим розчином і ставлять тільки на підноси або кювети;

при дослідженні матеріалу, що надійшов і при роботі з бактеріальними культурами дотримуються загальноприйняті в бактеріологічній практиці технічні прийоми, що виключають можливість інфікування працівника;

у процесі вивчення збудників інфекційних хвороб студенти повинні засвоїти особливості правил техніки безпеки під час роботи з конкретними збудниками;

розтин трупів експериментальних (лабораторних) тварин виробляють у спеціальному одязі на обладнаному столі за допомогою необхідних інструментів, використовуючи для цих цілей кювету, залиту воском (або парафіном). Інструменти після розтину на стіл класти забороняється: їх поміщають у склянку з дез-розчином або випалюють над полум'ям пальника;

під час роботи з рідким інфікованим матеріалом використовують гумові балони, з'єднані з піпеткою;

якщо в процесі роботи патологічний матеріал випадково потрапив на стіл, його негайно видаляють тампоном, змоченим розчином, що дезінфікує. При попаданні зараженого матеріалу на шкіру, кон'юнктиву, у ротову порожнину вживають екстрених заходів до знезараження;

після закінчення роботи патологічний матеріал, використані культури мікроорганізмів, інструменти та поверхня столу знезаражують;

наприкінці заняття бактеріальні культури та інший матеріал студенти повинні здати викладачеві, а робоче місце упорядкувати. Виносити із лабораторії пробірки з культурами, препарати (мазки) та інші предмети категорично забороняється;

патологічний матеріал та бактеріальні культури, необхідні для подальшої роботи, залишають на зберігання у закритому рефрижераторі або сейфі;

Перед виходом з лабораторії необхідно зняти халат, руки ретельно вимити і обробити йодованим спиртом. Виходити за межі лабораторії у халатах забороняється;

Дотримання правил роботи та техніки безпеки на навчальних заняттях з мікробіології контролюють чергові. З технікою безпеки під час роботи на кафедрі мікробіології студенти знайомляться на першому занятті, про що розписуються у журналі.

Дотримуючись перелічених правил, співробітник у лабораторії забезпечує стерильність маніпуляцій і попереджає виникнення внутрішньо- та позалабораторного зараження.

Веде лабораторні записи. Зошит для лабораторних робіт є документом, що дозволяє контролювати правильність отриманих даних. До неї мають бути занесені відомості, що стосуються виконання цієї роботи. Запис необхідно вести акуратно, чітко та у визначеному порядку, наприклад: 1) назву досвіду, дата його постановки та закінчення; 2) об'єкт дослідження; 3) умови проведення досвіду; 4) основний принцип використовуваного методу аналізу; 5) результати досвіду.

Отримані результати докладно описують, чи цифровий матеріал зводять у таблиці, якщо необхідно, у графіки, діаграми, малюнки. Кожна лабораторна робота має закінчуватися власними спостереженнями та висновками, занесеними до робочого зошита.

У процесі роботи студенти опановують техніку та методи мікроскопування, знайомляться з морфологією представників різних груп мікроорганізмів, освоюють підхід до виділення чистих культур та їх ідентифікації, вивчають вплив умов та факторів довкілля на зростання та утворення різноманітних продуктів життєдіяльності мікроорганізмів та знайомляться з деякими методами генетичних досліджень. бактерій.

ЗАГАЛЬНА МІКРОБІОЛОГІЯ